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胁迫粟水溶性蛋白的制备与抗氧化性研究

作　者: 李景军
导　师: 陈正行
学　校: 江南大学
专　业: 粮食、油脂及植物蛋白工程
关键词: 粟 胁迫萌发 水提取物 纯化 胁迫机制 抗氧化作用
分类号: S515
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


粟（Millet）粟属禾本科（Gramineae）、狗尾草属（Setaria italica）草本植物,是世界上主要粮食作物之一。粟可分为小米（Foxtail millet,学名:Setaria italica）、龙爪稷（Finger millet,学名:Eleusine coracona）、小粟（Little millet,学名:Panicum sumatrense）、库都粟（Kodo millet,学名:Paspalum scorbiculatum）四种,在世界各地均有分布,有很好的营养和保健功能。已有报道粟的乙醇粗提物因含有多酚类物质而具有体内外抗氧化作用,粟米蛋白具有抗动脉粥样化的功能。但对其萌发水提取物的主要成分及其抗氧化作用尚未见详细的报道,本文研究其胁迫萌发水提取物中胁迫蛋白的抗氧化作用,为开发利用粟的营养价值和保健功能提供有力的科学依据,为研究开发保健食品提供可以借鉴的新方法,具有有重要的学术意义和实践价值。粟的四种可溶性粟米蛋白中,其水溶性蛋白羟自由基清除活性极低,水萌发后的水提取物活性也很低,采用胁迫萌发的方法有力地提高了其活性。使用析因实验和中心组合实验方法优化得到了最佳的胁迫培养基组成,提取物的羟自由基清除作用达到使用优化得到的培养基萌发粟,得到水溶性蛋白的羟自由基清除作用达到58.16%。在研究粟的胁迫萌发制备条件时,选择温度、时间和pH值为影响因素,使用响应面分析方法,找到了影响羟自由基抑制活性的关键参数,优化了温度和pH值两个关键参数,得到了最佳萌发条件。使用优化的胁迫培养基,在胁迫萌发温度28℃、萌发pH值7.6、胁迫萌发时间52h得到水溶性蛋白的羟自由基清除作用达到60.18%。研究了胁迫萌发粟水溶性蛋白的分离纯化方法,分别使用了离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法和高效液相色谱法对其进行分离纯化,并得到了高纯度的胁迫蛋白。使用离子交换色谱分析了胁迫粟水提取物的分子量分布情况,分离得到了十个组分,鉴定其羟自由基清除活性发现其活性大小顺序为:F4＞F5＞F1＞F3＞F6＞F2＞F7＞F8＞F9＞F10,确定三个较大活性组分含氮物的分子量分布全都是连续的;使用凝胶过滤色谱分析了F4和F5的组成情况,共得到五个组分,活性测定结果说明它们的活性大小顺序是:P2＞P3＞P1＞P5＞P4;使用反相色谱分析了P2和P3的组成情况,共分离得到了四个主要组分,活性测定其大小顺序为B＞D＞C＞A;相对分子质量分析确定组分B的相对分子质量为11084,D为11136;二者纯度均达到90%以上。采用以上分离方法是行之有效的。研究了胁迫萌发过程中水提取物的成分变化和粟胁迫萌发与无胁迫萌发的六种酶及活性强度变化情况,并结合胁迫对粟的生理影响对胁迫蛋白产生的可能机理进行了探讨。胁迫萌发72小时内,可溶性蛋白上升再下降最后趋于稳定;淀粉酶、蛋白酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷光甘肽过氧化物酶和呼吸强度的胁迫萌发指标与相应无胁迫萌发的指标比较表明,萌发进程也比无胁迫萌发大大提前;胁迫萌发对粟的生理影响很大,胁迫蛋白的产生可能是由于培养基中的刺激物兼有第一信使和第二信使的作用,导致发生蛋白酪氨酸磷酸化作用和mRNA的形成,并翻译形成胁迫蛋白,整个过程受氧化还原作用的调控。研究了粟胁迫蛋白的抗氧化性质。体外抗氧化实验证明,粟胁迫蛋白的还原能力,对亚油酸体系中抗氧化作用、清除DPPH·和O2·—的能力,均与其浓度呈量效关系;体内抗氧化作用实验证明,灌服胁迫粟水提取物和粟胁迫蛋白样品可以显著提高D-半乳糖导致亚急性衰老小鼠血清中SOD和全血中GSH-Px的活力,能够清除过剩自由基,显著降低小鼠血清中MDA含量,起延缓衰老的作用,所造衰老模型是成功的。胁迫粟水提取物效果比粟胁迫蛋白更显著。

全文目录


中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
第一章 绪论  12-33
  1.1 粟的概况  12-15
    1.1.1 粟的分类、产量及其分布  12-13
    1.1.2 粟的营养成分与功能  13-14
    1.1.3 粟的研究与利用现状  14-15
  1.2 粟米蛋白研究进展  15-18
    1.2.1 粟米蛋白的营养及其氨基酸组成  15-18
    1.2.2 粟米蛋白的制取与组成分析  18
  1.3 生物加工对粟米蛋白的影响  18-19
    1.3.1 萌发对粟米蛋白的影响  18-19
    1.3.2 发酵对粟米蛋白的影响  19
  1.4 粟米功能活性蛋白  19-20
    1.4.1 抗菌蛋白  19
    1.4.2 应激蛋白  19-20
    1.4.3 β-淀粉酶  20
  1.5 自由基与抗氧化  20-23
    1.5.1 自由基的特性及产生途径  20-21
    1.5.2 自由基的危害与其抑制剂  21-23
  1.6 谷物萌发基础与生物体抗性诱导研究概况  23-25
    1.6.1 谷物的萌发  23-24
    1.6.2 谷物萌发的生理生化  24
    1.6.3 植物的抗逆境防御反应  24-25
  1.7 本课题立题意义和主要研究内容  25-26
    1.7.1 本课题立题背景和意义  25-26
    1.7.2 本课题主要研究内容  26
  参考文献  26-33
第二章 粟蛋白成分及其抑制羟自由基水溶性蛋白胁迫培养基研究  33-50
  2.1 前言  33
  2.2 材料与方法  33-37
    2.2.1 实验材料  33
    2.2.2 主要仪器  33-34
    2.2.3 实验方法  34-37
  2.3 结果与讨论  37-46
    2.3.1 脱脂粟的化学成分分析  37
    2.3.2 粟蛋白成分分析  37-38
    2.3.3 粟米蛋白等电点的确定  38
    2.3.4 粟米蛋白的氨基酸组成  38-39
    2.3.5 粟的不同提取物的羟自由基抑制作用比较  39
    2.3.6 不同处理粟水提取物羟自由基清除作用与主要抗氧化成分分析  39-40
    2.3.7 过氧化氢对幼芽形态及发芽率的影响  40-41
    2.3.8 过氧化氢对羟自由基清除作用的影响  41-42
    2.3.9 液体培养基成分对粟水溶性蛋白羟自由基清除作用的影响  42-46
  2.4 本章小结  46-47
  参考文献  47-50
第三章 提高羟自由基清除活性的粟胁迫萌发工艺研究  50-61
  3.1 前言  50-51
  3.2 材料和仪器  51-52
    3.2.1 材料  51
    3.2.2 主要仪器  51-52
  3.3 实验方法  52
    3.3.1 粟的萌发  52
    3.3.2 胁迫粟水提取物的制备  52
    3.3.3 分析方法  52
  3.4 结果与讨论  52-59
    3.4.1 粟胁迫萌发过程中的单因素实验  52-55
    3.4.2 响应面分析方法优化胁迫粟萌发工艺  55-58
    3.4.3 粟胁迫萌发产生羟自由基清除活性的最佳工艺参数的确定  58
    3.4.4 结论  58-59
  3.5 本章小结  59
  参考文献  59-61
第四章 胁迫粟抗氧化蛋白的分离纯化与性质研究  61-77
  4.1 前言  61-62
  4.2 材料和仪器  62-64
    4.2.1 实验材料  62-63
    4.2.2 主要仪器  63-64
  4.3 实验方法  64-65
    4.3.1 粟的萌发  64
    4.3.2 胁迫粟水提取物的制备  64
    4.3.3 分析方法  64-65
  4.4 结果与讨论  65-74
    4.4.1 胁迫粟水提取物的成分  65
    4.4.2 最大吸收波长的确定  65-66
    4.4.3 胁迫粟水提取物的高效液相色谱分析  66-67
    4.4.4 胁迫粟水提取物的离子交换色谱分析  67-70
    4.4.5 高活性组分的凝胶过滤色谱  70-71
    4.4.6 高活性组分的反相色谱  71-73
    4.4.7 各步分离的纯化回收率与比活力  73
    4.4.8 讨论  73-74
  4.5 本章小结  74-75
  参考文献  75-77
第五章 胁迫萌发粟产生抗氧化蛋白的机理初探  77-96
  5.1 前言  77-78
  5.2 材料与仪器  78-79
    5.2.1 实验材料  78
    5.2.2 主要仪器  78-79
  5.3 实验方法  79-81
    5.3.1 粟的萌发  79
    5.3.2 胁迫粟水提取物的制备  79
    5.3.3 胁迫粟酶提取液的制备  79
    5.3.4 分析方法  79-81
  5.4 结果与讨论  81-89
    5.4.1 粟胁迫萌发过程中水提取物主要成分变化  81-82
    5.4.2 淀粉酶活性变化  82-83
    5.4.3 蛋白酶活性变化  83-84
    5.4.4 多酚氧化酶活性变化  84-85
    5.4.5 过氧化氢酶活性变化  85-86
    5.4.6 超氧化物歧化酶活性变化  86-87
    5.4.7 谷胱苷肽过氧化物酶活性变化  87-88
    5.4.8 萌发粟呼吸强度的变化  88-89
  5.5 胁迫蛋白产生机制的探讨  89-92
    5.5.1 胁迫对粟萌发生理代谢过程的影响  89
    5.5.2 粟的胁迫蛋白产生机制探讨  89-92
  5.6 本章小结  92-93
  参考文献  93-96
第六章 胁迫萌发粟水提取物及其纯化蛋白抗氧化活性研究  96-108
  6.1 前言  96-97
  6.2 材料和仪器  97
  6.3 实验方法  97-99
    6.3.1 胁迫蛋白体外抗氧化活性研究  97-99
    6.3.2 粟胁迫蛋白体内抗氧化活性研究  99
  6.4 结果与讨论  99-106
    6.4.1 粟胁迫蛋白的还原能力  99-100
    6.4.2 胁迫蛋白对O_2~(.-)的清除作用  100-101
    6.4.3 粟胁迫蛋白在亚油酸体系中的抗氧化作用  101-102
    6.4.4 粟胁迫蛋白对DPPH·抑制作用  102
    6.4.5 胁迫粟水提取物不同洗脱部分的体内抗氧化作用比较  102-103
    6.4.6 粟胁迫蛋白对小鼠体重及行为的影响  103
    6.4.7 胁迫蛋白对小鼠血清MDA含量的影响  103-104
    6.4.8 胁迫蛋白对小鼠血清SOD的影响  104-105
    6.4.9 胁迫蛋白对小鼠全血中GSH-Px的影响  105
    6.4.10 讨论  105-106
  6.5 本章小结  106
  参考文献  106-108
主要结论和创新点  108-110
致谢  110-111
攻读博士学位期间发表与待发的论文  111

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 粟（谷子、小米）
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