学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

普鲁兰短梗霉HN2-3菌株碱性蛋白酶的纯化、基因克隆、表达、表面展示及生产活性肽的应用研究

作　者: 尼秀媚
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 海洋酵母 普鲁兰短梗霉 碱性丝氨酸蛋白酶 基因克隆 表面展示 生物活性肽
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 265次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


从分离自海水、海泥及海洋生物内脏及海生植物表面的400余株酵母菌中分离到5株产蛋白酶的海洋酵母，能在酪蛋白双层平板上形成明显的透明圈，它们分别是HN2-3、N13d、N13C、Mb5和HN3-2。通过酵母鉴定的常规方法并结合分子生物学方法，鉴定出HN2-3、N13d、N13C与HN3-24株菌属于普鲁兰短梗霉（Aureobasidiumpullulans），Mb5菌株属于解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）。来自菌株HN2-3所产蛋白酶酶活性及酶解活性肽产物的ACE（AngiotensinI-converting enzyme）抑制活性最高。来自菌株HN2-3的蛋白酶命名为ALP2。利用层析柱Sephadex G-75与阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化了菌株HN2-3的胞外碱性蛋白酶ALP2，纯化2．34倍。通过SDS-PAGE凝胶电泳，得到的ALP2蛋白条带分子量为33．0 kDa，最适作用温度为52℃。Mn2+、Mg2+和Na+离子浓度在5 mM时对纯化蛋白酶酶活有激活作用，Zn2+、Ca2+、K+和Li+对酶活的影响不大；而当存在Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ag+、和Hg2+离子时，蛋白酶活明显降低。苯甲基磺酰氟（PMSF）强烈抑制蛋白ALP2的活性，乙二胺四乙酸（EDTA）与碘乙酸微弱抑制蛋白酶的活性。利用纯化的酶酶解砺虾蛋白，螺旋藻蛋白（Arthospiraplatensis），酵母N3C（Yarrowia，lipolytica）和YA03a（Hansenia sporauvarum）蛋白，来自蛎虾蛋白的水解物ACE抑制活性与抗氧化活性最高，分别达到88．3％与47．3％。这说明纯化的ALP2蛋白酶在食品和医药方面具有良好的前景。利用简并PCR、反向PCR与RT-PCR获得了蛋白酶ALP2基因的DNA序列与cDNA序列。基因ALP2的DNA序列为1354 bp，在NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）的登陆号为EU331441。ALP2基因的开放阅读框（ORF）1248 bp，在NCBI上的登陆号为EU224431，编码415个氨基酸，推导分子量为42．9 kDa。基因ALP2具有两个内含子，分别为54bp和52 bp。通过分子生物学软件分析，基因ALP2前18个氨基酸为信号肽序列，此基因编码的蛋白具有丝氨酸活性位点与组氨酸活性位点，等电点为6．44。利用质粒pINA1317对基因进行表达验证，发现转化子能在牛奶-PPB双层平板上形成明显的透明圈。转化子的发酵上清液的蛋白酶活性也进行了检测，结果说明克隆到的基因ALP2确实为蛋白酶基因，而且能在Y.lipolytica中进行表达，并分泌到细胞外。利用本实验室构建的表面展示质粒pINA1317-YICPW110对蛋白酶基因ALP2进行了表面展示，转化子能在牛奶双层平板上形成明显的透明圈。表面展示的蛋白酶酶解不同的蛋白源能够产生活性肽，发现酶解金黄色隐球酵母G7a（Cryptococcus aureus）的细胞蛋白所产活性肽的ACE抑制活性最高，酶解螺旋藻蛋白所产活性肽的抗氧化活性最高。这是首次关于利用表面展示蛋白酶进行活性肽的生产的报道。将表面展示的蛋白酶进行了酶学特性研究，发现与菌株HN2-3所产的野生型蛋白酶相比，最适作用温度有所降低，温度稳定性增强；另外发现表面展示的蛋白酶对金属离子的亲和力降低。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章 绪论  14-45
  前言  14-15
  第一节 蛋白酶的研究进展  15-24
  第二节 生物活性肽的研究进展  24-35
  第三节 表面展示技术的研究进展  35-41
  第四节 海洋酵母的研究进展及本研究的目的与意义  41-45
第二章 产蛋白酶海洋酵母的筛选  45-59
  1 前言  45
  2 材料和方法  45-52
    2.1 材料  45-47
    2.2 方法  47-52
  3 结果与讨论  52-58
    3.1 产蛋白酶海洋酵母的筛选  52-53
    3.2 5株海洋酵母的鉴定  53-56
    3.3 酶解蛎虾蛋白所产活性肽的ACE抑制活力测定  56-58
  4 本章小结  58-59
第三章 A.pullulans HN2-3蛋白酶的分离纯化、特性研究及酶解不同蛋白源产活性肽的研究  59-79
  1 前言  59-60
  2 材料和方法  60-66
    2.1 材料  60-61
    2.2 方法  61-66
  3 结果与讨论  66-77
    3.1 蛋白酶发酵液浓缩及Sephadex~(TM) G-75凝胶层析部分纯化  66-67
    3.2 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化化  67-69
    3.3 不连续SDS-PAGE凝胶电泳  69-70
    3.4 纯化蛋白酶最适作用温度与温度稳定性  70-72
    3.5 纯化蛋白酶最适作用pH与pH稳定性  72-73
    3.6 金属离子对蛋白酶ALP2酶活的影响  73-74
    3.7 蛋白抑制剂对纯化蛋白酶ALP2酶活的影响  74-75
    3.8 蛋白水解产物ACE抑制活性和抗氧化活性  75-77
  4 本章小结  77-79
第四章 A.pullulans HN2-3蛋白酶基因克隆与信息学分析  79-112
  1 前言  79-81
  2 材料和方法  81-93
    2.1 材料  81-84
    2.2 方法  84-93
  3 结果和讨论  93-111
    3.1 简并PCR引物的设计  93-97
    3.2 简并PCR克隆碱性蛋白酶ALP2部分基因  97-98
      3.2.1 A.pullulans HN2-3基因组DNA的提取及简并PCR  97-98
      3.2.2 简并PCR结果  98
    3.3 反向PCR获得碱性蛋白酶ALP2全部基因  98-100
      3.3.1 反向PCR引物设计  99
      3.3.2 限制性内切酶酶切基因组DNA及连接环化  99
      3.3.3 反向PCR  99-100
    3.4 碱性蛋白酶基因ALP2生物信息学分析  100-111
      3.4.1 序列在NCBI的比对结果及碱性蛋白酶基因ORF框推测  100-101
      3.4.2 反转录PCR  101-105
      3.4.3 碱性蛋白酶ALP2氨基酸序列分析  105-111
  4 本章小结  111-112
第五章 普鲁兰短梗霉HN2-3蛋白酶基因APL2的表达  112-124
  1 前言  112-113
  2 材料与方法  113-117
    2.1 材料  113-114
    2.2 方法  114-117
  3 结果与讨论  117-123
    3.1 受体菌的选择  117-119
    3.2 PMD19-T simple-ALP2重组质粒构建  119-120
    3.3 连接表达载体的阳性克隆的检测  120-121
    3.4 含蛋白酶基因的质粒片断转化Y.lipolytica Polh  121
    3.5 转化子蛋白酶活力的测定  121-123
  4 本章小结  123-124
第六章 A.pullulans HN2-3蛋白酶ALP2的表面展示及表面展示蛋白酶的特性研究  124-143
  1 前言  124-125
  2 材料和方法  125-129
    2.1 材料  125-126
    2.2 方法  126-129
  3 结果与讨论  129-141
    3.1 蛋白酶ALP2表面展示质粒构建  129-130
    3.2 PMD19-T Vector simple-ALP2重组质粒的构建  130-131
    3.3 重组质粒pINA1317-YICPW110-ALP2的构建  131-133
    3.4 含蛋白酶基因的质粒片断转化Y.lipolytica Polh  133
    3.5 免疫荧光反应  133-134
    3.6 转化子蛋白酶活力的测定  134-136
    3.7 具6×His标签的表面展示蛋白的特性研究  136-141
      3.7.1 表面展示蛋白酶最适作用pH与pH稳定性  136-138
      3.7.2 表面展示蛋白酶最适作用温度和温度稳定性  138-139
      3.7.3 金属离子对表面展示蛋白酶ALP2酶活的影响  139
      3.7.4 蛋白抑制剂对表面展示蛋白酶ALP2酶活的影响  139-141
  4 本章小结  141-143
第七章 表面展示蛋白酶ALP2酶解不同蛋白源产活性肽的研究初步  143-150
  1 前言  143-144
  2 材料和方法  144-146
    2.1 材料  144-145
    2.2 方法  145-146
  3 结果与讨论  146-149
    3.1 蛋白水解产物抑制ACE活性与抗氧化活性  146-148
    3.2 表面展示蛋白酶使用周期的测定  148-149
  4 本章小结  149-150
参考文献  150-162
总结与创新点  162-164
发表的学术论文  164-165
附录  165-167
致谢  167

相似论文

  1. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  2. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  3. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  4. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  5. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  6. 硅、硫对水稻砷吸收、积累的影响机制研究,S511
  7. 多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究,X172
  8. 烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析,Q943.2
  9. 氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达,X172
  10. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  11. 红曲霉洛伐他汀生物合成相关基因克隆与分析,TQ927
  12. 产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能分析,TQ925
  13. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  14. 荧光假单胞菌7-14生物膜突变株的筛选及tatC基因的克隆与功能初析,S432.4
  15. 烟夜蛾气味受体基因和精氨酸激酶基因的克隆与表达分析,S433.4
  16. 新疆小麦1Dx5基因的分离克隆及表达载体构建,S512.1
  17. 短柄草磷转运蛋白基因的克隆与功能分析,S543.9
  18. 野生种马铃薯蛋白酶抑制剂基因CYS和API的克隆及SpCYS转化马铃薯和烟草的初步研究,S532
  19. 地被菊匍匐茎横向重力性相关基因的发掘,S682.11
  20. 萝卜镉胁迫响应相关基因克隆及其表达分析,S631.1
  21. 逐渐干旱对牡丹实生苗生理指标的影响和牡丹GA20-氧化酶基因的克隆与序列分析,S685.11

中图分类: > 生物科学 > 微生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com