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人促甲状腺激素受体抗体定量荧光酶免法的建立及临床应用

作　者: 李宁
导　师: 方佩华
学　校: 天津医科大学
专　业: 影像医学与核医学
关键词: 自身免疫性甲状腺病格雷夫氏病人促甲状腺激素受体膜外区人促甲状腺激素受体抗体基因重组原核表达荧光酶免疫分析
分类号: R581
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)是一类多发病,包括Graves病(Graves’disease, GD)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)等。GD是甲状腺毒症最常见类型,促甲状腺激素受体(TSH receptor, TSHR)是GD的主要抗原,在病理条件下可刺激机体产生TSHR抗体(thyrotropin receptor antibody, TRAb), TRAb包括甲状腺刺激性抗体(thyroid stimulating antibody, TSAb)、甲状腺刺激阻断性抗体(thyroid stimulating blocking antibody, TSBAb)和中性抗体等自身抗体。其中TSAb可刺激甲状腺激素分泌增多致甲亢。TSAb是GD的主要病因,对GD的发生发展起重要作用。TSHR分膜外区(TSHR-ecd).跨膜区和膜内区,TRAb结合位点主要分布在TSHR-ecd,研究表明TSAb的抗原表位主要分布于TSHR-ecd的氨基端(TSHRn)。本室在研究TSHR抗原决定簇分布的基础上,将TSHR-ecd分段表达,进行了抗原决定簇分布的筛选,在TSHR-ecd氨基端筛选出主要与TSAb结合的抗原决定簇相对集中的基因片段(TSHRn462bp),并进行原核表达,获得了能与TSAb结合的该基因片段编码的融合蛋白,即硫氧还蛋白-人促甲状腺激素受体膜外区氨基端片段蛋白(TrxFus-hTSHRn),为建立TRAb(以TSAb为主)检测技术奠定了基础。荧光酶免疫分析技术(fluorescent-enzyme immunoassay, FEIA)是在酶联免疫分析技术(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)基础上,通过测定酶催化荧光底物发出的荧光强度而建立的一种定量检测超微量物质的荧光酶免疫分析技术,其比ELISA更灵敏、测量范围更宽。本研究以重组TrxFus-hTSHRn为抗原,建立定量检测人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA,并应用于临床,为AITD的诊疗提供依据。目的：应用基因工程技术原核表达hTSHR膜外区氨基端片段基因,获取TrxFus-hTSHRn融合蛋白,以此为抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA,并应用于临床,探讨其对AITD特别是GD的诊断、鉴别诊断、疗效监测和预后的临床价值。方法：1.人TSHR膜外区氨基端融合蛋白(TrxFus-hTSHRn)原核表达、纯化及鉴定将本室构建的hTSHRn-ecd重组表达质粒pET 102/D-hTSHRn462bp转入表达工程菌E.Coli BL21StarTM(DE3),诱导表达目的蛋白,经变性Ni2+-NTA(镍一氮川乙酸)亲和层析纯化,梯度透析复性、浓缩,获得重组TrxFus-hTSHRn,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定其分子量,蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定免疫活性。2.以TrxFus-hTSHRn为抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA及方法学鉴定将重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn包被聚苯乙烯96孔板,以待测样品血清中TRAb为第一抗体,以本室制备的TRAb校准品(WHO推荐的TRAb参考制剂(WHO NIBSC 90/672)的“二次校准物”)建立标准曲线,碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG为第二抗体,4-甲基磷酸伞形酮(4-MUP)为荧光底物建立定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA。最佳实验条件的探索：(1)抗原包被量(2)待测样品血清稀释度(3)荧光底物稀释度(4)荧光底物反应时间(5)反应终止液作用时间等因素组合后做交叉试验,确定最佳实验条件。鉴定该法灵敏度、特异性、精密度、准确度、健全性、相关性等指标。检测167例正常人血清样品(均为男性,年龄19-28岁(22.6±2.7)),确立阳性切点值(cut-off point value)。3.定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA的临床应用检测6种甲状腺疾病患者559例,分为8组①Graves’病(GD)甲亢初发组：183例(男81例,女102例,年龄18-70岁(40.6±11.2))；②GD治疗3-9个月组：56例(男20例,女36例,年龄28-68岁(39.6±11.0))；③GD治疗1年组：64例(男33例,女31例,年龄32-65岁(42.1±13.9)),④桥本甲状腺炎(HT)初发伴甲减组：112例(男39例,女73例,年龄24-79岁(44.5±13.1))；⑤单纯性甲状腺肿大组：22例(男8例,女14例,年龄19-67岁(42.0±13.1))；⑥结节性甲状腺肿组：49例(男28例,女21例,年龄22-60岁(31.0±12.5))；⑦临床诊断甲状腺腺瘤组：21例(男10例,女11例,年龄17-68岁(38.7±12.4))；⑧亚急性甲状腺炎组：52例(男24例,女28例,年龄21-66岁(45.0±9.0))。4.统计方法人血清TRAb(以TSAb为主)测定浓度(mlU/L)以“均数±标准差”(x±s)表示。组间比较采用方差分析(ANOVA),各组阳性率比较采用卡方检验(χ2检验)。变量间相关分析采用直线相关分析和一致性检验(kappa分析)。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.人TSHR膜外区氨基端融合蛋白(TrxFus-hTSHRn)原核表达、纯化及鉴定含重组表达质粒pETl 02/D-hTSHRn462bp的表达工程菌E.Coli BL21 StarTM (DE3)在2×YT培养基中37℃过夜摇菌(200rpm)培养,以异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thoiglactoside, IPTG)为诱导剂,终浓度1mM,37℃诱导4小时,产物在变性条件下Ni2+-NTA亲和层析纯化,梯度透析复性、浓缩,获得重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn,经SDS-PAGE测定TrxFus-hTSHRn分子量约为37.5KD,纯度约91.2%,考马斯亮蓝(CBG)法定量,不同批次生产的融合蛋白产率约为21.5-28.4mg/L培养基,Western Blotting鉴定TrxFus-hTSHRn免疫活性良好。2.以TrxFus-hTSHRn为抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA及方法学鉴定2.1最佳实验条件TrxFus-hTSHRn抗原包被量100ng/孔,4℃过夜；待测样品血清稀释度1：100,37℃温育60分钟；碱性磷酸酶标记羊抗人IgG二抗稀释度1：20000,37℃温育60分钟；荧光底物4-MUP稀释度1：10,37℃避光温育60分钟；加反应终止液50mM乙二胺四乙酸(EDTA),37℃避光温育5分钟后在荧光仪上测定相对荧光单位(RFU)计数。2.2标准曲线以WHO推荐的TRAb参考制剂(WHO NIBSC 90/672)的“一次校准物”(Medizym(?) T.R.A.Calibrators)为标准(对照品),对本室制备的TRAb校准品进行标定,并结合临床建立本法的标准曲线,各点浓度分别为(S1-S5)0.07mIU/L, 0.22mIU/L,0.72mIU/L,4.26mIU/L,9.68 mIU/L。2.3结果计算待测样品血清1：100稀释后测得的RFU值在标准曲线上对应的浓度值×100(样品稀释倍数)即为待测样品血清的TRAb(以TSAb为主)浓度(mIU/L)。2.4方法学鉴定①灵敏度：本法检测灵敏度0.05mIU/L。②特异性：TrxFus-hTSHRn与hTRAb特异性结合,与人甲状腺过氧化物酶抗体(hTPOAb)无交叉结合反应。③精密度：阳性血清、阴性血清批内变异(CV%)(n=6)分别为4.47%和9.25%。批间变异(CV%)(n=8)分别为7.29%和13.57%。④准确度：测定高、中、低浓度样品回收率分别为102.13%、97.50%、98.00%,平均回收率97.46%。⑤健全性：将GD甲亢患者血清进行两次对倍稀释后做平行实验,血清样品稀释曲线(r=0.9983)与标准曲线(r=0.9979)成平行关系,本法健全性良好。⑥相关性：本法与意大利索林(DiaSorin)公司放射受体法(RRA) TRAb检测试剂盒同检51例GD患者(不同疗程)血清样品,两法检测结果显著相关(r=0.767,P<0.05；一致性检验kappa=0.791, P<0.01).2.5确定阳性切点值检测167例健康男性血清TRAb(以TSAb为主)浓度为(x±s)23.5±9.7mIU/L,以x+2s(单侧95%可信区间)为阳性切点值,即42.9 mIU/L。3.定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA的临床应用3.16种甲状腺疾病患者血清TRAb(以TSAb为主)含量(mIU/L)分析①GD初发组(142.5±23.2)显著高于其它各组(P均<0.01)。②GD治疗1年组(75.6±35.0)与GD治疗3-9个月组(93.1±30.3)无显著差别(P>0.05),这两组均显著低于GD初发组(142.5±23.2)(P均<0.01),但均仍显著高于正常人(23.5±9.7)(P均<0.05)。③GD治疗3-9个月组(93.1±30.3)、GD治疗1年组(75.6±35.0)、HT初发伴甲减组(71.3±14.7)均显著高于单纯性甲状腺肿组(25.6±12.0)、结节性甲状腺肿组(38.7±13.5)、甲状腺腺瘤组(41.0±8.8)、亚急性甲状腺炎组(40.3±10.6)(P均<0.05)。④单纯性甲状腺肿组、结节性甲状腺肿组、甲状腺腺瘤组、亚急性甲状腺炎组与正常人无显著差别(P均>0.05)。3.26种甲状腺疾病患者血清TRAb(以TSAb为主)阳性率分析①GD初发甲亢组阳性率(88.94%)高于其它各组(p均<0.01)。②GD治疗1年组阳性率(38.62%)低于GD治疗3-9个月组(64.09%)(P<0.05),这两组阳性率均显著低于GD初发甲亢组(88.94%)(P均<0.05),但仍均显著高于正常人(4.91%)(P均<0.01)。③GD治疗3-9个月组(64.09%)、GD治疗1年组(38.62%)、HT初发伴甲减组(61.88%)均显著高于单纯性甲状腺肿组(0.85%)、结节性甲状腺肿组(3.71%)、甲状腺腺瘤组(5.01%)、亚急性甲状腺炎组(11.69%)(P均<0.05)④单纯甲肿、甲状腺腺瘤、结甲肿、亚甲炎组与正常人无统计学差异(P均>0.05)结论：1.重组表达质粒pET 102/D-hTSHRn462bp在E.Coli BL21 StarTM(DE3)中高效表达,获得了能与TSAb结合的hTSHRn-ecd重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn,该蛋白纯度约91.2%,产率21.5-28.4mg/L培养基,免疫活性好。2.制备并标定了TRAb校准品,建立了以重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn为抗原、以96孔板为固相载体的定量检测人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA。本法灵敏、特异、稳定、简便。3.本法用于甲状腺疾病患者临床观察,GD甲亢患者检测阳性率较高,本法对AITD特别是GD甲亢的诊断、鉴别诊断、疗效观察有重要价值,对AITD与非AITD的鉴别诊断也有重要意义。

全文目录

中文摘要  4-9
Abstract  9-13
缩略语/符号说明  13-14
前言  14-19
  研究现状、成果  14-17
  研究目的、方法  17-19
一、人TSHR膜外区氨基端融合蛋白(TrxFus-hTSHRn)原核表达、纯化及鉴定  19-29
  1.1 对象和方法  19-23
  1.2 结果  23-25
  1.3 讨论  25-27
  1.4 小结  27-29
二、以TrxFus-hTSHRn为抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA及方法学鉴定  29-43
  2.1 对象和方法  29-33
  2.2 结果  33-38
  2.3 讨论  38-42
  2.4 小结  42-43
三、定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA临床应用  43-53
  3.1 对象和方法  43-46
  3.2 结果  46-50
  3.3 讨论  50-51
  3.4 小结  51-53
结论  53-54
参考文献  54-61
发表论文和参加科研情况说明  61-62
综述重组人TSHR和人血清TRAb检测技术的研究进展  62-74
  综述参考文献  68-74
致谢  74

人促甲状腺激素受体抗体定量荧光酶免法的建立及临床应用

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