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calpain及calpastatin在小鼠皮肤切创愈合过程中作用的研究

作　者: 张巍
导　师: 官大威
学　校: 中国医科大学
专　业: 法医病理学
关键词: 皮肤切创凋亡 Ca2+ calpain calpastatin caspase-3 calpain抑制剂 MDL28170 免疫组织化学 Western blot检测酶活性多型核细胞单核细胞成纤维细胞损伤时间
分类号: D919
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

前言皮肤创伤后的修复反应首先是血液凝固、血小板激活,然后,炎症细胞、成纤维细胞、肌纤维母细胞等趋化、增殖,最后是肉芽组织经改建成熟形成纤维结缔组织。在此期间,机体通过凋亡机制清除“多余”细胞,调控损伤区域的细胞动态平衡,保证受损组织的修复。我们的前期研究结果表明,在皮肤损伤愈合过程中,caspase-3,-6,-7可能在诱导中性粒细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞发生凋亡过程中发挥重要作用。calpain是钙激活中性蛋白酶（calcium-activated neutral protease）,涉及到细胞骨架的重塑、信号转导、细胞周期调控和凋亡。calpain1和calpain2广泛分布于绝大多数哺乳动物组织中。calpain是由分子量为80KD的催化亚单位和分子量为30KD的调解亚单位组成的异二聚体。calpain与Ca²⁺结合后自溶激活。目前尚未见有报道研究皮肤创伤后calpain1和calpain2的表达及活性变化,也未见研究calpain抑制剂对皮肤损伤愈合影响的报道。故本实验采用H.E染色、免疫组织化学染色、Western blot检测、比色法等技术方法检测小鼠皮肤切创愈合过程中calpain1、calpain2和其内源性抑制剂calpastatin的表达和激活情况,同时应用calpain抑制剂MDL 28170,观察calpain和caspase-3的活性变化,研究calpain是否在皮肤损伤愈合过程中被激活以及calpain-calpastatin系统变化情况,为calpain在皮肤凋亡中的作用和与caspase-3关系研究提供帮助。实验材料和方法健康成年清洁级昆明系小鼠124只,雌雄不限,鼠龄8周,体重28-32克,由中国医科大学实验动物中心提供。其中有9只小鼠因伤后感染未被分组计数,其余115只小鼠随机分为23个组,每组5只。9个损伤组按伤后0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d分组及其一个正常皮肤对照组。6个抑制剂组给予calpain抑制剂,按伤后6h、12h、1d、3d、5d和7d分组。7个对照组包括6个抑制剂对照组和1个假手术组,给予DMSO生理盐水稀释液。给予乙醚吸入麻醉后,在小鼠背部中央作一1.5cm长纵行皮肤全层切口。在规定实验时间内将小鼠颈椎脱位处死。用100%DMSO将MDL28170溶解,再用生理盐水配制成浓度为1mg/ml的MDL28170注射液（DMSO终浓度为2%）。抑制剂组切创后即首次腹腔内注射,剂量为24mg/kg,以后每12小时重复给药一次,并在处死前2h再给药一次,每次剂量为12mg/kg。对照组小鼠按体重给予与抑制剂组相同剂量的含2%DMSO的生理盐水。在皮肤创口处剪取1.5cm×1.0cm皮肤组织处理后进行H.E.染色、免疫组织化学染色、Western blot检测和calpain、caspase-3的酶活性测定。实验数据用（?）±s表示,在SPSS for Windows 12.0软件进行统计学方差分析。实验结果第一部分:皮肤切创愈合过程中calpain及calpastatin表达的研究1、皮肤切创愈合的病理形态学变化伤后6h,可见多型核细胞（根据细胞核形态命名,主要为中性粒细胞）浸润增多;伤后12h,皮下组织内有大量渗出和浸润的多型核细胞及少量单个核细胞;伤后1d,创缘周围有大量的炎性细胞浸润,以单个核细胞为主;伤后3d,肉芽组织增多,成纤维细胞开始增生;伤后5d,炎细胞减少,大量新生毛细血管、成纤维细胞及纤维细胞出现;伤后7d,肉芽组织大量形成,成纤维细胞增生达高峰;伤后10～14d,肉芽组织开始纤维化。2、皮肤切创愈合过程中calpain1、calpain2和calpastatin免疫组织化学研究calpain1、calpain2和calpastatin阳性表达主要分布于多型核细胞、单个核细胞和成纤维细胞（细胞种类主要根据形态来区分）。三者的阳性细胞比率存在时间规律性。3、皮肤切创愈合过程中calpain1、calpain2和calpastatin蛋白表达的研究calpain1、calpain2和calpastatin的表达存在时间规律性变化,calpain1和calpain2前体蛋白表达在伤后5d达高峰,其裂解片段的表达分别在伤后3d和5d明显增多,calpastatin降解片段在伤后3d表达最大。4、calpain和caspase-3酶活性检测伤后1d,calpain相对活性值大幅度升高（187.377±7.136%）,经过明显下降之后,伤后5d,再次升高达最大值（208.253±6.098%）。伤后12h至5d,caspase-3活性倍数增值持续升高至最大值（41.095±2.022）,经过明显下降之后,伤后10d,再次升高（39.635±1.575）。第二部分:calpain抑制剂MDL28170对小鼠皮肤切创愈合过程的影响观察1、calpain抑制剂MDL28170对病理形态学变化的影响抑制剂组皮肤创口愈合过程较对照组快。伤后7d,组织学观察到抑制剂组小鼠皮肤切创区较对照组新增长上皮层次多,活跃,表皮完全愈合。2、calpain抑制剂MDL28170对calpain1、calpain2和calpastatin表达影响的免疫组织化学研究抑制剂组伤后1d,calpain1阳性细胞率明显增加至高峰,达（61.526±6.422%）,伤后3d,明显下降,在伤后5d至7d,阳性细胞率明显增加。各抑制剂组阳性细胞率与相应对照组相比较均存在显著性差异。抑制剂组伤后6h至12h,calpain2阳性细胞数呈小幅度增加,在伤后1d,下降至最低（43.760±5.295%）,以后,阳性细胞率逐渐增加,至伤后7d,阳性细胞率达高峰（53.940±4.589%）。各抑制剂组阳性细胞率与相应对照组相比较均存在显著性差异。抑制剂组calpastatin阳性细胞率在伤后6h最低（36.962±4.541%）,在伤后1d至7d,阳性细胞率逐渐增加,至伤后7d达高峰（87.799±4.941%）。从伤后12h至7d,抑制剂组的calpastatin阳性细胞率与相应对照组相比较均存在显著性差异。从伤后6h至7d,抑制剂组的calpain1和calpain2阳性细胞率明显低于对照组。从伤后12h至7d,抑制剂组的calpastatin阳性细胞率明显高于对照组。3、calpain抑制剂MDL28170对calpain1、calpain2和calpastatin表达影响的蛋白表达研究抑制剂组calpain1和calpain2前体蛋白杂交条带染色强度以伤后6h时为最低,随损伤时间的延长而逐渐增强,在伤后7d达最大。伤后6h至7d,检出染色强度较弱的calpain1和calpain2裂解片段蛋白杂交条带。抑制剂组calpastatin82kDa裂解片段蛋白杂交条带染色强度在伤后6h最低,以后逐渐增加,在伤后7d达最大。从伤后6h开始,calpastatin50kDa裂解片段蛋白杂交条带染色强度逐渐增加,至伤后3d达最大,以后蛋白杂交条带染色强度逐渐下降。除7d外,抑制剂组calpain1前体表达明显低于对照组,抑制剂组calpain1和calpain2活性片段表达明显低于对照组。calpastatin裂解片段杂交条带染色强度明显高于对照组。4、calpain抑制剂MDL28170对calpain和caspase-3酶活性影响的研究在伤后6h至1d抑制剂组calpain相对活性值开始逐渐增加,伤后3d有所下降,在伤后5d,其相对活性值达最大（151.667±55.487%）,在伤后7d达最低值（131.730±7.087%）。抑制剂组caspase-3活性倍数增值在伤后6h最低（5.952±1.407）,以后逐渐增加,至5d达高峰（30.270±1.830）。伤后12h至7d,抑制剂组calpain相对活性值和caspase-3活性倍数增值均明显低于对照组。讨论目前有关calpain抑制剂的研究已成为一个热点。由于calpastatin分子量为110kDa,不具有细胞膜的渗透作用,尽管其对calpain具有特异性抑制作用,但它不是一个理想的研究试剂。随着生化和药理学技术的进步,已经开发出许多新的calpastatin抑制剂。MDL28170（Z-Val-Phe-CHO）是新一代的肽基醛类抑制剂,属可逆性抑制剂,具有良好的细胞膜渗透作用,通过其醛基部分与calpain活性部位的硫醇形成半硫醛中间体而抑制calpain活性。因此本研究选用MDL28170作为干预剂,研究calpain在凋亡中的作用以及其与caspase-3的关系。一、正常小鼠皮肤中calpain及calpastatin的表达正常小鼠皮肤的表皮层、汗腺、毛囊和皮肌层均检测出calpain1、calpain2和calpastatin蛋白表达。calpain2在维持皮肤稳态即在calpain生理性作用中发挥更重要的作用,calpain1在皮肤遭受损伤即在calpain病理性作用中发挥更重要的作用。二、小鼠皮肤切创愈合过程中calpain的作用本研究通过酶活性检测及Western blot检测证实在小鼠皮肤切创愈合过程中calpain1和calpain2被激活,它们与皮肤切创愈合机制相关。三、小鼠皮肤切创愈合过程中calpain与caspase-3的关系本实验在给予MDL28170治疗后,明显抑制了calpain的活性,同时,caspase-3活性也显著下降。说明在小鼠皮肤切创愈合过程中calpain和caspase-3共同被激活,calpain是在caspase-3上游参与了皮肤损伤后的细胞凋亡。四、MDL28170对小鼠皮肤切创愈合的影响给予MDL28170后,发现小鼠皮肤切创愈合速度明显较对照组快,这些数据都证明calpain抑制剂MDL28170可以明显抑制calpain和caspase-3的激活,且有可能在一定程度上减少皮肤损伤后的细胞凋亡,对小鼠皮肤切创愈合具有明显的促进作用。五、小鼠皮肤切创愈合过程中中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的迁移、凋亡机制本研究calpain酶活性测定、calpain1免疫组织化学染色和Western blot检测结果显示在伤后6h至1d calpain2呈高度表达,calpain1活性在伤后6h和12h处于较低水平,伤后1d达最大。这说明了calpain的激活在小鼠皮肤切创后中性粒细胞凋亡中发挥重要作用。皮肤切创后calpain2轻度激活引起中性粒细胞等炎症细胞迁移、游走,在创口及其周围发生炎症反应。伤后6h至12h,calpain1活性处于较低水平,中性粒细胞大量增生,伤后1d,calpain1活性迅速升高,calpastatin的裂解片段低水平表达,介导中性粒细胞发生凋亡。免疫组织化学染色显示伤后1d,calpain1和calpain2阳性细胞率分别达到86.272%和83.769%,提示有可能是单核细胞大量增生的结果。此时,酶活性检测与Western blot检测显示calpain活性明显增加,因此说calpain1和calpain2极有可能与单核细胞的大量增生、游走及凋亡密切相关。本研究酶活测定和Western blot检测结果显示calpain1和calpain2活性在伤后5d至10d一直处于较高水平,免疫组织化学染色显示calpain1、calpain2和calpastatin在处于静止期的成纤维细胞染色弱,伤后5d至10d,大量增生的成纤维细胞呈强阳性反应,阳性细胞率在成纤维细胞增生期处于较高水平,表明calpain-calpastatin系统极有可能在成纤维细胞的增生和凋亡中发挥重要作用。六、calpain1、calpain2和calpastatin在皮肤损伤愈合时间推断上的应用本实验免疫组织化学染色及Western blot检测结果证实calpain1、calpain2和calpastatin的表达存在时间规律性变化,尤其是calpain1有望成为皮肤损伤时间推断上具有实际应用价值的参考指标。结论1、正常小鼠皮肤中calpain1、calpain2和calpastatin在表皮层、汗腺、毛囊和皮肌层定位表达。2、小鼠皮肤切创愈合过程中calpain1和calpain2均被激活。3、小鼠皮肤切创愈合过程中calpain在caspase-3上游参与细胞凋亡。4、抑制calpain活性可加速了小鼠皮肤切创愈合进程。5、calpain参与单核细胞和成纤维细胞的增生,并有可能与单核细胞和成纤维细胞凋亡关系密切。6、calpain1有望成为皮肤损伤时间推断上具有实际应用价值的参考指标。

全文目录

一、摘要  4-16
  中文论著摘要  4-10
  英文论著摘要  10-16
二、英文缩略语  16-17
三、论文  17-72
  前言  17-20
  实验材料和方法  20-25
  实验结果  25-63
    第一部分:皮肤切创愈合过程中calpain及calpastatin表达的研究  25-41
    第二部分:calpain抑制剂 MDL28170对小鼠皮肤切创愈合过程的影响观察  41-63
  讨论  63-71
  结论  71-72
四、本研究创新性的自我评价  72-73
五、参考文献  73-77
六、附录  77-89
  综述  77-87
  在学期间科研成绩  87-88
  致谢  88-89
  个人简介  89

calpain及calpastatin在小鼠皮肤切创愈合过程中作用的研究

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