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背景与目的酗酒后轻微外力所致的外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)死亡案件的发生率呈上升趋势,已引起国内外法医学工作者的关注。本课题组建立的大鼠灌酒后TSAH模型稳定性好,前期结果显示慢性灌酒组大鼠TSAH发生率及死亡率分别为81%、76%,远高于急性灌酒组的27%、4.8%(P<0.01)。综合相关文献及本课题组前期实验结果分析,认为长期酗酒的中枢神经系统(CNS)累积毒理作用参与了酗酒后TSAH的死亡机制,然而酒精对脑干生命中枢组织形态结构及物质代谢损伤性变化导致酗酒TSAH大鼠迅速死亡的机制尚不十分明确,因此,本课题拟从慢性灌酒大鼠脑干组织m-Calpain/ Calpastatin免疫表达与病理形态变化的关联性角度,探讨长期酗酒后TSAH迅速死亡的机制。材料与方法1实验动物及分组情况CL级雄性SD大鼠65只,体重300±30g,分笼常规饲养,随机分:单纯灌水组(W)10只、灌水+打击组(WH) 10只、单纯灌酒组(A) 10只、灌酒+打击组(AH)29只、灌酒+停酒组(AS)6只。连续灌胃食用水或白酒(52%v/v北京红星二锅头)4周,剂量:前2周8 ml/kg/次、后2周12 ml/kg/次,每天9:00和16:00间隔7h两次灌酒。2实验方法各组大鼠4周后分别处置:单纯灌水组(W)和单纯灌酒组(A)均戊巴比妥腹腔注射麻醉后股动脉放血处死;灌水+打击组(WH)和灌酒+打击组(AH)使用自制单摆式打击装置给予脑震荡性打击,同时监测心电15min,其中灌酒+打击组(AH)中死亡的大鼠归为灌酒打击死亡组;灌酒+停酒组(AS)连续灌胃4周后,停酒常规饲养4周,戊巴比妥腹腔注射麻醉后股动脉放血处死。开颅取全脑,正中矢状切取大脑+脑干+小脑,左侧半脑常规制备石蜡连续切片,行HE、甲苯胺蓝及m-Calpain、Calpastatin免疫组织化学染色,光镜观察组织病理形态,病理真彩色图像分析系统4.0(CMIASWIN)观测、采图,Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量累积积分光密度(总IOD)和平均积分光密度(平均IOD)。3统计分析所有数据均采用均数±标准差(x±s)表示,通过SPSS 17.0及Excel 2003分析处理实验数据,检验方法采取方差分析(ANOVA)、独立样本T检验、卡方检验。统计学检验所得值差异显著性采用P<0.05、P<0.01表示。结果1一般情况及TSAH发生率及死亡率大鼠灌酒1周后体重下降(P<0.05);约两周后相继出现毛发粗糙、灰黄、脱落、无光泽、精神萎靡、两眼混暗无光,进食减少,消瘦,大便稀溏等情况;3周后体重下降明(P<0.01)。灌水组大鼠一般状况良好,体重呈持续生长性增加;2周后体重差异显著(P<0.05)。本实验慢性灌酒+打击组(AH) TSAH发生率(79.3%)和死亡率(51.7%)高于其他各组(P<0.01)。2实验大鼠打击前后心电变化灌水+打击组(WH)和灌酒+打击组(AH)打击前后大鼠心率变化无显著差异(P>0.05);灌水+打击组(WH)心电图呈一过性心率减慢、QRS波群波幅增大,0.3±0.16s后恢复;灌酒+打击组(AH)大鼠心率减慢、QRS波群波幅明显增大,恢复时间1.7±0.36s,较灌水+打击组(WH)明显延长(P<0.05);灌酒打击死亡组大鼠心电严重异常,心率和各波群波幅明显不规整。3常规大体和组织病理学观察单纯灌水组(W)脑表面光泽,HE染色神经元、胶质细胞形态和分布正常,神经纤维排列规整、紧密、粗细均匀,甲苯胺蓝染色神经元边界清晰,胞浆均匀淡紫蓝色,胞核大而圆、染色质均匀、核仁清晰,尼氏小体分布核周质及树突内,深蓝色着色,呈大小不等小块状或颗粒状。灌水+打击组(WH)神经元及胶质细胞轻度水变性,尼氏小体颜色变浅、数目减少,神经纤维排列疏松,白质聚集性网状疏松,未见TSAH及明显脑挫裂伤等病变。单纯灌酒组(A)神经元排列紊乱、数目减少,散在固缩深染1型变和肿胀淡染2型变神经元,胞体肿大变圆,胞核增大、偏位,尼氏小体溶解、消失;胶质细胞增生;小脑蒲肯野细胞数目减少、疏密不均。灌酒+打击组(AH)脑表面淤血,厚层斑片状TSAH,主要分布脑干腹侧面,未见明显脑挫裂伤,神经元及神经胶质细胞高度水变性、周隙扩大,多见核固缩、溶解、消失,尼氏小体不同程度边集、溶解、消失,多见噬神经及卫星现象;散在神经元脱失,胶质细胞增生;小脑蒲肯野细胞明显减少、染色不均,疏密不均、核固缩;延髓多见红色神经元及暗神经元;神经纤维疏松水肿、周隙增宽,可见明显不规则增粗、扭曲、断裂神经纤维,白质聚集性网状疏松。灌酒+停酒组(AS)大鼠较单纯灌酒组(A)和灌酒+打击组(AH)神经元及神经纤维病变缓解不明显,但脑干暗神经元数减少,水肿程度明显减轻。4透射电镜观察单纯灌水组(W)神经元线粒体、高尔基复合体、内质网丰富,大小形态、排列规整,突触丰富,突触囊泡聚集;轴索致密、粗细均匀,神经微管及微丝排列规则、粗细均匀。灌水+打击组(WH)神经元线粒体疏松肿胀、嵴扩张,内质网轻度扩大,散在轴索、微管及微丝疏松水肿,神经毡内突起轻度空泡变,突触囊泡相对减少。单纯灌酒组(A)神经元线粒体明显疏松肿胀、嵴长短粗细不一、外膜不完整;可见胞体、核固缩神经元,核膜皱褶、异染色质增多、聚集,核仁固缩,神经毡内突触数量较少;胶质细胞增多,间质疏松水肿,轴索疏松水肿、粗细不均,髓鞘不规则脱脂分层呈网状。灌酒+打击组(AH)可见神经元体积明显缩小、胞浆及核电子密度增高的固缩神经元,核膜皱褶,异染色质团块状聚集,核仁消失或变小,核浆比例增大,胞周缝隙增宽,胞膜不完整(1型变);疏松水肿,线粒体和内质网明显疏松肿胀(2型变);神经纤维病变最重,髓鞘扭曲、同心圆层和网状分离,絮状物附着,微管及微丝崩解,终扣突触囊泡聚集,突触数量减少;胶质细胞增多,间质水肿。灌酒+停酒组(AS)大鼠神经元及神经纤维病变缓解缓解不明显,水肿程度明显减轻。5免疫组织化学观察单纯灌水组(W)脑组织神经元及胶质细胞胞浆和胞膜m-Calpain表达较低、Calpastatin表达较高,主要分布脑干腹背侧核团、小脑颗粒层和蒲肯野细胞。两因素方差分析结果显示,不仅打击和慢性灌酒对大鼠脑组织m-Calpain及Calpastatin IOD值具有极显著的影响(P<0.01),而且打击和慢性灌酒的交互作用对脑干各部位m-Calpain及Calpastatin IOD值影响也非常显著(P<0.05,P<0.01)。单纯灌水组(W)较其他各组m-Calpain表达最少、Calpastatin表达最多,慢性灌酒+打击组(AH)则m-Calpain表达最多、Calpastatin表达最少。灌水打击组(WH)和单纯灌水组(W)在小脑和脑干各部位m-Calpain及Calpastatin IOD值差异不明显(P>0.05),慢性灌酒打击死亡组脑干后腹侧m-Calpain IOD均值比慢性灌酒打击存活组高(P<0.05),而Calpastatin IOD均值低(P<0.05)。结论1、慢性酒精中毒可引发CNS组织结构及超微结构的病理变化,出现的暗神经元为一种可逆性病理变化,特别是慢性酒精中毒打击后脑组织暗神经元数量明显增多,提示其为酗酒与外力协同参与慢性酒精中毒大鼠高死亡率机制的病理形态基础。2、慢性酒精中毒与脑震荡性打击的交互作用导致脑组织,特别是脑干生命中枢的神经元m-Calpain高表达、Calpastatin低表达,提示酗酒与外力即可分别又可协同激活Calpain信号系统,参与CNS神经元损伤,可能是慢性酒精中毒TSAH高死亡率的病理代谢基础。3、结合本课题组前期工作结果,认为酗酒相关的TSAH,酒精CNS毒理学效应起着重要的作用,特别是长期酗酒的慢性酒精累积性作用与脑震荡性打击具有协同作用。
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