|
在我们国家,癫痫的患病率约为十万分之七,其中难治性癫痫占20%～25%。难治性癫痫中,最常见的一种类型便是颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE),占难治性癫痫总数的60%上下。研究显示,65%～70%的颞叶癫痫患者,存在一侧海马硬化,病理学上表现为海马神经元脱失、胶质细胞增生。尽管对海马、杏仁核进行选择性的切除,可使一部分癫痫病人得以痊愈,但手术本身即可引起偏瘫、偏盲、记忆损害等等,且对双侧海马硬化的患者,不宜作双侧切除。因此,探索通过细胞移植治疗,进行海马功能的修复、重建,具有重要的临床意义。神经干细胞(neural stem cells,NSCs),是指具有分化为神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞的能力,能进行自我更新,并提供足够神经细胞的细胞。自上世纪90年代以来,随着NSCs相继成功地从胚胎和成体哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system,CNS)中分离培养出来,打破了传统的中枢神经系统受损后不可再生的观点,为治疗CNS疾病提供了一条崭新的途径。针对NSCs的科学研究,也随即成为神经科学领域研究的热点。NSCs和γ-氨基丁酸(gama aminobutyric acid,GABA)能神经元移植治疗TLE在众多实验中已被证实有效,但将两者的疗效进行比较的实验研究还未见有报道。本论文从大鼠TLE模型的制作,NSCs的分离培养、诱导分化以及细胞移植等方面作了一些探索性研究,希望能为进一步的研究提供参考。1、大鼠海人酸颞叶癫痫模型的制作。目的通过建模成功率的比较,探讨制作大鼠海人酸(kainic acid,KA)颞叶癫痫模型的合适给药剂量。方法SD大鼠80只,雄性,随机分为4组,分别向右侧海马注射浓度为0.5μg/μl的KA0.4μl、0.7μl、1.0μl和生理盐水1.0μl。术后按照Racine癫痫大鼠行为学分级标准观察4h,凡连续3次或3次以上达到Ⅳ～Ⅴ级发作的大鼠,即确定为成功模型。结果观察结束时,生理盐水组,大鼠全部存活,且未见癫痫发作。KA0.4μl组,1只死亡,1只Ⅴ级发作,6只Ⅳ级发作,9只Ⅲ级发作,3只Ⅱ级发作。KA0.7μl组,2只死亡,15只Ⅴ级发作,3只Ⅳ级发作。KA1.0μl组14只死亡,6只Ⅴ级发作。经统计学检验,KA 0.7μl组癫痫模型的成功率最高,P<0.05。结论右侧海马注射KA0.35μg建模效果较好。2、NSCs的分离培养、诱导分化及细胞移植。目的探讨NSCs的分离培养、向GABA能神经元诱导分化,并评价癫痫的细胞移植治疗。方法1)NSCs的分离培养及鉴定:孕12d SD大鼠麻醉消毒后,置于超净台内的无菌培养皿上,取出胚胎,浸于无血清DMEM液中。显微镜下剥离胎鼠脑组织,剪成1mm3小块,胰酶消化10～15min。含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)DMEM中止消化,100目滤网过滤,离心5min,不含血清DMEM洗涤3次,离心去上清,加入NSCs培养液,调整细胞浓度,接种于培养瓶,孵箱内培养。每2～3d半量更换培养液,7d后传代。取第3代神经球进行免疫荧光化学染色,检验nestin的表达。2)体外诱导NSCs向GABA能神经元分化并鉴定:取第3代神经球,吹打,离心,弃上清,加入GABA能神经元定向诱导分化液,接种于培养瓶内,孵箱内培养,每2～3d半量更换培养液。取诱导分化7d的细胞,进行免疫荧光染色,检验NF200、GAD67、GFAP的表达。3)大鼠TLE模型建立后第4d,将NSCs和GABA能神经元移植到模型右侧海马,分别于移植后4w、8w、12w连续7天观察大鼠的行为学改变,并于观察结束后处死大鼠,留取脑标本。常规Nissl染色、HE染色和免疫荧光染色,观察大鼠右侧海马损伤与治疗情况。结果1)取材接种2h后,显微镜下见数目较多,大小较均一的单个圆形细胞,核大,质少,折光率高。24h后克隆开始形成,后克隆球不断增殖,变大,6～7d后可见包含数百个细胞的大克隆球,免疫荧光nestine阳性。2)诱导分化2～3d后,细胞开始有突起长出,5～6d后,突起更加明显,部分细胞具神经细胞形态,免疫荧光可见NF200、GAD67、GFAP阳性细胞。3)在行为学方面,两细胞移植组在移植后8w时大鼠行为学改善最为明显,与对照组和未移植组比较具有统计学差异,P<0.05,但这一改善作用在NSCs移植组和GABA能神经元移植组之间无统计学差异。在病理学方面,NSCs移植组和GABA能神经元移植组,均于移植后8w时,海马CA3区神经元计数最多,与4w、12w比较,具有统计学差异,P<0.05。取8w时组间进行两两比较,海马CA3区神经元计数亦具有统计学差异,P<0.05。结论成功分离培养了NSCs,并在体外诱导NSCs向GABA能神经元方向分化。两细胞移植组,在行为学和病理方面均有所改善,这一改善作用在移植后8w时最为明显,且在病理学方面NSCs移植组优于GABA能神经元移植组。
|