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脑缺血后HIF-VEGF-Notch通路信号分子的变化及其与缺血区血管新血管新生的关系

作　者: 匡助才
导　师: 邓志锋
学　校: 南昌大学
专　业: 外科学
关键词: 缺血性脑卒中 HIF-1-VEGF-Notch信号通路血管内皮细胞增殖血管生成
分类号: R741
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景和目的：流行病学调查显示我国每年都有大量的脑血管病发生,在这些脑血管病中以缺血性疾病为主。缺血导致大量脑神经元发生不可逆性的变性坏死,出现严重的神经功能缺失。如能及早促进局部新生血管形成恢复血流再灌注,挽救半影区濒临死亡的神经细胞,对于缺血性脑卒中的治疗具有重大意义。血管内皮生长因子(VEGF)直接作用于内皮细胞参予新生血管形成,成为血管形成过程中最重要的成血管生长因子。同时Notch信号途径通过局部细胞间的相互作用也对血管的发育和形成构成重要影响。研究显示缺血缺氧损伤可以上调VEGF表达,激活Notch信号通路,VEGF调控Notch信号途径而促进新生血管形成。VEGF-Notch信号通路对血管的发育和形成起着非常重要的调控作用,但具体的调控机制尚未完全阐明,其间涉及到VEGF与VEGFR和Notch信号通路三者之间复杂的关系。缺氧诱导因子1(HIF-1)是在肝细胞和转基因动物上进行促红细胞生成素(EPO)基因表达研究时发现的一种转录因子。它能特异性感受机体缺氧变化,对维持机体氧平衡起到重要作用。HIF-1通过对下游靶基因的调节作用参予到缺氧后血管新生、细胞增殖凋亡、能量代谢等诸多病理生理过程中。缺血缺氧可诱导HIF-1生成,全面调节VEGF的表达。研究表明HIF-1-VEGF-Notch信号通路成为缺血缺氧后血管新生的主要调节路径。本研究主要观察体内脑缺血后HIF-1-VEGF-Notch通路信号分子HIF-1αVEGFR2、Notch1和Hes1蛋白的变化与缺血区血管新生的情况,探讨HIF-1-VEGF-Notch通路对促血管新生的主要调控作用机制,为将来精确调控内源性的脑血管生成,实现中枢神经系统损伤后的组织修复与功能重建提供理论依据,也为缺血性脑卒中治疗提供新思路。研究内容和方法：1、SD大鼠随机分正常组和缺血对照组,缺血对照组采用线栓法制作大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑缺血模型,于缺血再灌注后8h、1d、3d分批处死各组大鼠,取脑组织标本待检。2、脑组织标本冰冻切片行免疫组织化学荧光染色检测缺血区HIF-1α表达,×400高倍镜下计数HIF-lα阳性细胞数量；Westernblot方法同时检测各实验组缺血皮质区HIF-la蛋白表达情况,ImageJ软件分析其相对表达强度。3、脑组织标本冰冻切片行免疫组织化学荧光染色检测缺血区VEGFR2表达,每张切片在×400高倍镜下计数5个不同视野的VEGFR2阳性细胞数量；4、用Western-blot方法检测缺血脑皮质区notch 1和hesl蛋白,用ImageJ软件分析其相对表达强度情况；5、脑组织标本冰冻切片行免疫组化荧光双染检测脑缺血区Hes1和Ⅷ因子的表达,×400高倍镜下计数Hesl+Ⅷ双阳性的内皮细胞,了解缺血区血管新生情况。6、探讨HIF-1-VEGF-Notch通路对脑血管生成的主要调控作用机制结果：1、MCAO大鼠均出现程度不等的对侧肢体偏瘫、眼脸下垂、行走时原地转圈和向对侧倾斜、提尾向对侧侧身等神经功能缺失表现；TTC染色可见右侧大脑中动脉供血区呈苍白色而周围正常脑组织呈现红色；脑缺血损伤模型制作成功。2、SD大鼠皮质区HIF-1α表达：在脑缺血再灌注8h、1d、3d的SD大鼠缺血皮质区HIF-1α阳性细胞计数分别为2.60±1.52、3.20±1.30、12.60±10.41,与对照组0.40±0.55比较,缺血3d后HIF-1α阳性细胞数量显著增加。western blot检测缺血皮质区HIF-1α蛋白在8h、1d和3d的表达,其相对强度值分别为：0.40±0.027、1.76±0.1521和38±0.119,对照组为0.48±0.041。缺血1d和3d后HIF-1α蛋白表达显著增加,但3d较1d时有所下降。3、SD大鼠皮质区VEGFR2表达：在脑缺血再灌注8h、1d、3d的SD大鼠缺血侧皮质区VEGFR2阳性细胞计数分别为2.40±1.14、3.00±0.71和14.60±9.66,与对照组0.40±0.55比较,缺血3d后VEGFR2表达显著增加。4、SD大鼠皮质区notch1和hes-1表达：western blot检测缺血皮质区notch1蛋白表达,在8h、1d和3,其蛋白表达相对强度值为0.56±0.048、1.10±0.095和1.95±0.169,对照组为0.41±0.036,缺血1d和3d后Notchl显著增加,3d是达一峰值；缺血皮质区Hes1蛋白相对强度值为0.54±0.049、1.11±0.096和1.52±0.131对照组为0.86±0.074,缺血8h后Hes1蛋白表达显著低于正常水平,在1d和3d蛋白表达较正常显著增加。5、免疫组织化学荧光染色检测缺血皮质区在8h、1d和3d,其Hes1+Ⅷ因子双阳性细胞计数分别为9.00±2.24、24.8±4.44和36.4±6.27,对照组为14.0±2.35。缺血8h组较对照组低,此后表达渐增加,缺血3d后内皮细胞数达一峰值。结论：1、通过检测缺血脑皮质区HIF-la的变化,结果提示缺血后HIF-la的大量表达,其通过调控相应的下游靶基因,启动了血管新生的主要过程,对缺血后血管新生具有重要意义。2、通过检测脑组织缺血皮质区VEGFR2、notchl和hesl的表达变化,结果提示缺血后在HIF-1的作用下,VEGFR2表达增加,notch信号通路激活,有效的促进了缺血区微血管形成,VEGF-Notch信号通路对缺血后的血管形成具有重要调控作用。3、通过检测缺血区hesl+Ⅷ因子表达变化,结果表明缺血缺氧激活HIF-1-VEGF-Notch信号通路,随着HIF-1表达的增加,VEGF-Notch信号通路增加了血管内皮细胞的增殖,有效促使新生血管形成,使得HIF-1-VEGF-Notch信号通路在缺血后血管新生的过程中成为主要的调控途径。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
第1章引言  13-16
第2章材料与方法  16-26
  2.1 实验材料  16-18
    2.1.1 实验动物  16
    2.1.2 实验试剂和材料  16-17
    2.1.3 主要试剂的配制  17-18
    2.1.4 主要仪器  18
  2.2 实验方法  18-26
    2.2.1 器材的准备  18
    2.2.2 大脑中动脉栓塞(MCAo)模型的制作与实验分组  18-20
    2.2.3 缺血皮质区HIF-1α的检测  20-23
    2.2.4 缺血皮质区VEGFR2的检测  23
    2.2.5 缺血皮质区Notch信号通路相关分子的检测  23-25
    2.2.6 缺血皮质区微血管密度的检测  25
    2.2.7 统计学处理  25-26
第3章结果  26-31
  3.1 MCAO模型制备情况  26
  3.2 缺血皮质区HIF-1的表达  26-27
  3.3 缺血皮质区VEGFR2的表达  27
  3.4 缺血皮质区相关因子的Western-blot结果  27-29
  3.5 缺血皮质区微血管密度的变化  29-31
第4章讨论  31-38
  4.1 缺血性脑卒中的治疗与血管新生  31
  4.2 VEGF-Notch途径对血管生成的作用  31-35
  4.3 低氧诱导因子-1与VEGF  35-37
  4.4 HIF-1α-VEGF-Notch信号通路对血管生成的影响  37-38
第5章结论  38-39
致谢  39-40
参考文献  40-45
附图  45-49
综述  49-57
  参考文献  55-57

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