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尼莫地平和梓醇的神经保护作用

作　者: 李亚晨
导　师: 安利佳
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 尼莫地平小胶质细胞脂多糖帕金森病梓醇星形胶质细胞缺血神经退行性疾病
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

胶质细胞,中枢神经系统最丰富的细胞,被认为在中枢神经系统中起提供营养与支持,维持微环境,形成髓鞘,免疫监视和调节神经递质的作用。近来研究发现,胶质细胞还参与一系列中枢神经系统疾病,包括脑缺血和帕金森症等神经系统退行性疾病,并在这些疾病的发展过程中起重要的作用。本研究以LPS诱导大鼠中脑神经-胶质细胞混合培养体系中多巴胺神经元脱失为炎症介导的PD模型,以原代培养的星形胶质细胞氧糖剥夺-再复氧为体外缺血模型,探讨了尼莫地平和梓醇的神经保护作用。1.尼莫地平对炎症介导的多巴胺神经元退化的保护作用人们逐渐认识到脑内炎症反应在多种神经退行性疾病包括帕金森病和阿茨海默症中起着重要作用。炎症介导的神经退化与脑内在免疫细胞——小胶质细胞激活有关。激活的小胶质细胞产生前炎症因子和神经毒因子,包括细胞因子、活性氧自由基、一氧化氮和花生四烯酸代谢产物等,它们诱导神经元退化。因此,识别抑制小胶质细胞激活的化合物,有可能开发出治疗炎症调节的神经退行性疾病的药物。本研究应用中脑神经.胶质细胞混合培养体系,报道了尼莫地平,一种用于治疗心血管疾病的钙离子通道阻断剂,以剂量依赖的方式显著地阻止了LPS诱导的多巴胺神经元的变性。利用神经和胶质细胞重组培养,发现尼莫地平只有在小胶质细胞存在下,才能发挥其神经保护作用。此外,在去除小胶质细胞后的大鼠中脑神经.胶质细胞混合培养体系中,尼莫地平不能降低MPP⁺诱导的神经毒性,提示尼莫地平对神经元直接损伤无保护作用。由于尼莫地平显著抑制LPS诱导的小胶质细胞生成一氧化氮（NO）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白介素-1β（IL-1β）,花生四烯酸代谢产物.前列腺素E₂（PGE₂）和反应性氧自由基（reactive oxygenspecies,ROS）,表明尼莫地平对LPS诱导的多巴胺神经元的变性的保护作用是通过抑制小胶质细胞激活实现的。进一步研究显示,尼莫地平不能阻止LPS诱导的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶（PHOX）缺陷小鼠(PHOX^-/-)中的多巴胺神经元丢失,而明显地抑制LPS诱导的野生型小鼠(PHOX^+/+)PHOX胞质亚基p47phox向细胞膜的转位和多巴胺神经元丢失。这些结果提示,尼莫地平通过抑制小胶质细胞调节的氧化应激和炎症反应,保护多巴胺神经元免于损伤。此外,我们的研究揭示了PHOX是尼莫地平一个新的作用位点。因此,尼莫地平可能是一个治疗炎症相关的神经退行性疾病如帕金森病的潜在药物。2.梓醇对缺血诱导的星形胶质细胞损伤的保护作用脑缺血（Brain ischemia）是一种由于脑供血不足造成不可逆脑损伤而引起的一种急性神经系统退行性疾病,人们对其病理机制和防治措施进行了大量的研究,研究注意力主要集中在神经元上,治疗的策略也是针对阻止神经元功能的丧失。然而,近年来人们发现,脑缺血时星形胶质细胞的功能状态决定着缺血神经元的发展和转归。梓醇是一种环烯醚萜甙类小分子化合物,为传统中药地黄（Rehmannia glutinosa）的主要有效成分。先前研究发现,梓醇能够阻止脑缺血.再灌注诱导的沙土鼠CA1海马神经损伤,对脑缺血.再灌注导致的学习记忆障碍有明显的改善作用。本研究我们探讨了梓醇在缺血-再灌注诱导的星形胶质细胞损伤中作用及其作用机制。以原代培养小鼠星形胶质细胞氧糖剥夺-再复氧为体外缺血模型,通过四甲基偶氮唑盐（3-（4,5-dimethylthiazol-2-y1）-2,5-diphenyl-terazoliumbromide,MTT）比色分析,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）检测和形态观察,发现梓醇以剂量依赖的方式对缺血诱导的星形胶质细胞损伤具有明显的保护作用。此外,梓醇有效地阻止缺血引起的星形胶质细胞线粒体膜电位的降低,抑制活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）和一氧化氮（nitric oxide,NO）的生成,降低脂质过氧化物水平和诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的活性,提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）的活性,增加谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量。这些结果提示梓醇通过抑制自由基生成,提高抗氧化能力,从而保护缺血.再灌注诱导的星形胶质细胞损伤。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-13
引言  13-16
  研究背景  13
  选题依据  13-15
  研究目的与意义  15-16
1 文献综述  16-46
  1.1 小胶质细胞介导的免疫损伤在PD中的作用  16-24
    1.1.1 小胶质细胞简介  16-17
    1.1.2 小胶质细胞的激活  17-18
    1.1.3 小胶质细胞被激活的机制  18-19
    1.1.4 激活的小胶质细胞对神经元损伤的机制  19-21
    1.1.5 帕金森病中小胶质细胞激活的病理和流行病学证据  21
    1.1.6 帕金森病模型中小胶质细胞的激活  21-23
      1.1.6.1 MPTP  21-22
      1.1.6.2 6-OHDA  22
      1.1.6.3 鱼藤酮(rotenone)  22-23
      1.1.6.4 脂多糖(Lipopolysaeeharide,LPS)  23
    1.1.7 抑制小胶质细胞激活治疗帕金森病的前景  23-24
  1.2 星形胶质细胞的生理功能  24-30
    1.2.1 星形胶质细胞特征  25-26
      1.2.1.1 异质性  25
      1.2.1.2 可兴奋性  25-26
      1.2.1.3 胶质网络  26
      1.2.1.4 可塑性  26
    1.2.2 星形胶质细胞生理功能  26-30
      1.2.2.1 参与神经递质代谢  27
      1.2.2.2 维持神经元微环境的稳定  27-28
      1.2.2.3 营养修复作用  28
      1.2.2.4 抗氧化作用  28
      1.2.2.5 免疫调节作用  28-29
      1.2.2.6 星形胶质细胞与神经元的通讯  29-30
      1.2.2.7 参与跨突触的信号传递和能量代谢  30
    1.2.3 星形胶质细胞对脑缺血的反应及其神经保护作用  30
  1.3 脑缺血再灌注损伤机制  30-43
    1.3.1 兴奋性氨基酸毒性  31-32
    1.3.2 钙超载  32-33
    1.3.3 自由基损伤  33-38
      1.3.3.1 自由基生成的机制  33-35
      1.3.3.2 自由基损伤的作用机制  35-37
      1.3.3.4 细胞清除自由基的机制  37-38
    1.3.4 NO  38
    1.3.5 炎症  38-39
    1.3.6 细胞凋亡  39-41
    1.3.7 缺血性脑损伤神经保护的策略  41-43
      1.3.7.1 兴奋性氨基酸拮抗剂  41
      1.3.7.2 钙通道阻滞剂  41-42
      1.3.7.3 自由基清除剂  42
      1.3.7.4 抑制炎症反应  42-43
  1.4 尼莫地平和梓醇药理作用研究概况  43-46
    1.4.1 尼莫地平药理作用研究概况  43-44
    1.4.2 梓醇药理作用研究概况  44-46
2.尼莫地平对LPS诱导的多巴胺神经元损伤的保护作用  46-73
  2.1 实验材料与设备  47-48
    2.1.1 实验动物  47
    2.1.2 主要试剂  47-48
    2.1.3 主要仪器  48
    2.1.4 药物配制  48
  2.2 实验方法  48-56
    2.2.1 大鼠中脑神经-胶质细胞混合培养(Midbrain Neuron-glia Culture)  48-49
    2.2.2 大鼠中脑纯神经元培养(Midbrain Neuron-enriched Culture)  49-50
    2.2.3 纯小胶质细胞的培养(Microglia-enriched Culture)  50
    2.2.4 大鼠中脑神经元-星形胶质细胞培养(Microglia-depleted Culture)  50
    2.2.5 HAPI细胞培养  50
    2.2.6 DA摄取能力的检测  50-51
    2.2.7 免疫细胞化学分析(Immunocytochemistry,ICC)  51
    2.2.8 亚硝酸盐的测定  51-52
    2.2.9 TNF-α,IL-1β和PGE_2的测定  52-53
    2.2.10 实时反转录聚合酶链式反应分析(real-time RT-PCR)  53-55
    2.2.11 流式细胞仪分析  55
    2.2.12 统计学分析方法  55-56
  2.3 结果  56-69
    2.3.1 尼莫地平对LPS诱导多巴胺神经元损伤的保护作用  56-61
    2.3.2 小胶质细胞是尼莫地平神经保护作用的靶细胞  61-64
    2.3.3 尼莫地平抑制LPS诱导小胶质细胞的激活和炎症因子的产生  64-69
  2.4 讨论  69-71
  2.5 小结  71-73
3.NADPH氧化酶在尼莫地平保护LPS诱导的多巴胺神经元损伤中的作用  73-82
  3.1 实验材料与设备  73-74
    3.1.1 实验动物  73-74
    3.1.2 主要试剂  74
    3.1.3 主要仪器  74
  3.2 实验方法  74-75
    3.2.1 中脑神经-胶质细胞混合培养(Midbrain Neuron-glia Culture)  74
    3.2.2 纯小胶质细胞的培养(Microglia-enriehed Culture)  74
    3.2.3 HAPI细胞培养  74
    3.2.4 超氧自由基的测定  74
    3.2.5 DA摄取能力的检测  74
    3.2.6 TNF-α的测定  74
    3.2.7 实时反转录聚合酶链式反应分析(real-time RT-PCR)  74-75
    3.2.8 共聚焦显微镜分析  75
    3.2.9 统计学分析方法  75
  3.3 实验结果  75-79
    3.3.1 尼莫地平对LPS诱导的超氧离子生成和gp91基因表达的影响  75
    3.3.2 尼莫地平抑制LPS诱导的胞浆PHOX p47phox蛋白亚基的转位  75-79
    3.3.3 NADPH氧化酶是尼莫地平神经保护作用的靶点  79
  3.4 讨论  79-81
  3.5 小结  81-82
4.梓醇保护原代培养的星形胶质细胞免于缺血诱导的损伤  82-101
  4.1 实验材料及设备  83-84
    4.1.1 实验动物  83
    4.1.2 试剂  83
    4.1.3 实验设备  83-84
    4.1.4 溶液配制  84
  4.2 实验方法  84-89
    4.2.1 原代星形胶质细胞的培养  84
    4.2.2 体外缺血模型的建立  84-85
    4.2.3 细胞活力检测  85
    4.2.4 细胞形态学观察  85-86
    4.2.5 ROS和MDA含量测定  86
    4.2.6 NO含量和iNOS活性测定  86-87
    4.2.7 SOD,GSH-Px酶活性和GSH含量的测定  87-88
    4.2.8 线粒体膜电位的测定  88
    4.2.9 统计学分析方法  88-89
  4.3 实验结果  89-97
    4.3.1 梓醇对星形胶质细胞活力的影响  89-91
    4.3.2 梓醇对星形胶质细胞形态的影响  91-93
    4.3.3 梓醇对ROS和MDA含量的影响  93-94
    4.3.4 梓醇对NO生成和iNOS活性的影响  94-95
    4.3.5 梓醇对SOD、GSH-Px的活性和GSH含量的影响  95-96
    4.3.6 梓醇对星形胶质细胞线粒体膜电位的影响  96-97
  4.4 讨论  97-99
  4.5 小结  99-101
结论与展望  101-103
  结论  101-102
  展望  102-103
创新点  103-104
参考文献  104-124
附录缩略词表  124-126
攻读博士学位期间发表学术论文情况  126-127
致谢  127-128

尼莫地平和梓醇的神经保护作用

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