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水体Hg~（2+）对中华绒螯蟹毒性作用研究

作　者: 赵艳民
导　师: 王新华
学　校: 南开大学
专　业: 动物学
关键词: 汞(Hg2+) 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 鳃肝胰腺外骨骼积累消化酶代谢酶抗氧化酶金属硫蛋白(MT) 显微结构超微结构蜕皮生长存活
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

中华绒螯蟹是年产值超过百亿元的中国支柱水产养殖种类。汞是危害最严重的环境污染物之一。本研究以该蟹作为研究对象,综合形态学、生理学、生物化学、毒理生态学的方法和技术,辅以电镜、生化酶学、微量元素分析等手段,旨在阐明水体Hg²⁺对该种动物的毒性作用机制。全文由五章组成。第一章对国内外水体重金属对甲壳动物毒性作用的相关研究的进行了回顾和综述,综合报道了国内外有关重金属对甲壳动物毒性作用研究的主要进展,以及在研究内容、研究方法存在的局限性,并提出本论文采取的技术路线。第二章研究了水体Hg²⁺对中华绒螯蟹扣蟹蜕皮、生长和存活的影响及蟹体内汞含量的分布情况。实验研究表明水体Hg²⁺对扣蟹24、48、72和96 h的LC₅₀分别是0.6248、0.5716、0.5332和0.4423 mg/l。在0.00、0.01、0.05、0.10、0.20和0.30 mg/l水体Hg²⁺浓度处理下,扣蟹的存活率、体重、增重率、蜕皮数和蜕皮率的变化趋势趋于一致,均为随水体Hg²⁺浓度的增高而降低。汞暴露40天后,蟹体内汞含量随着水体Hg²⁺浓度的上升而上升,三种组织中汞含量为:鳃＞肝胰腺＞外骨骼,据此说明鳃和肝胰腺是该蟹类汞蓄积的主要器官。第三章研究了不同水体Hg²⁺浓度组（同第二章浓度处理）对中华绒螯蟹前鳃、后鳃和肝胰腺显微和超微结构的影响。0.01 mg/l Hg²⁺处理组蟹前鳃和后鳃组织结构相比对照组都没有出现显著变化,随水体Hg²⁺浓度的升高,鳃组织结构出现明显的病理变化,且变化程度随着水体Hg²⁺浓度的升高而加深,病理表现为:上皮细胞肿胀,鳃叶厚度增加,血腔减小,末端膨大,角质膜出现波状拱起,血细胞数目增加,鳃丝间分泌物大量出现,鳃叶扭曲,末端首先坏死,随后柱状细胞开始破损解体,上皮层解体,整体结构破坏严重,鳃叶空泡化等。鳃超微结构对Hg²⁺更加敏感,0.01 mg/l Hg²⁺浓度组即出现一定的病理变化,随着水体Hg²⁺浓度的逐渐升高,病理变化也逐渐加深,如角质膜增厚,电子密度变得不均一;鳃腔内出现颗粒型血细胞和透明血细胞,线粒体“嵴”受损,上皮细胞开始与角质层脱离,细胞质空泡化,内部出现染色较深的电子致密颗粒,上皮崩解,细胞原生质部分松散,缺乏细胞结构等病理变化。研究表明0.05 mg/l及以上的Hg²⁺浓度组对肝胰腺组织结构影响显著,表现为:肝小管R细胞数目增多,排列不规则,细胞之间相互挤压,细胞核位置参差不齐,形成假复层柱状上皮的结构;基膜形成波纹状拱起并开始脱离上皮细胞,细胞肿胀,空泡化且空泡内存在黑色物质,部分细胞破裂,细胞物质外流,上皮细胞变性解体,横切面已经完全丧失了正常的结构,基膜与细胞层之间形成较大的空泡,细胞崩解的碎片充斥管腔之中。电镜观察蟹肝胰腺在0.01 mg/lHg²⁺浓度组已经出现病理变化,且病理变化随着水体Hg²⁺浓度的升高而加深,具体的病理变化包括:线粒体内部“嵴”结构断裂,出现空泡,核仁物质浓缩,细胞质空泡增多,细胞原生质崩解,基膜增厚,疏松,细胞空泡化。第四章研究了水体Hg²⁺对中华绒螯蟹组织生化酶和金属硫蛋白的影响。肝胰腺和血淋巴超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）以及丙二醛（MDA）的含量。结果表明肝胰腺和血淋巴超氧化物歧化酶随着水体Hg²⁺浓度的升高呈现出先上升后下降的变化趋势,两种组织中的SOD活性最高值分别出现在0.05和0.01 mg/l Hg²⁺处理组,为15.91和260.12U/mg蛋白。肝胰腺GPX和血淋巴GPX活性变化趋势有所不同,随着水体Hg²⁺浓度的升高,肝胰腺GPX活力先上升,后下降,0.01 mg/l Hg²⁺处理组酶活力位13.13U/mg蛋白,为最大值;而血淋巴GPX活力则持续下降。肝胰腺和血淋巴内的CAT活性在不同Hg²⁺浓度处理组的变化情况较为相似,随着水体Hg²⁺浓度的升高呈现“高-低-高”的变化趋势,酶活力的最高值均出现在0.05 mg/l Hg²⁺处理组。丙二醛是脂质过氧化作用的产物之一。本实验中,肝胰腺和血淋巴丙二醛含量都是随着水体Hg²⁺浓度的上升而升高,表明水体Hg²⁺诱发体内脂质过氧化反应逐步加剧。中华绒螯蟹鳃钠钾三磷酸腺苷酶（Na⁺-K⁺-ATPase）、钙镁三磷酸腺苷酶(Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase)活力随着水体Hg²⁺浓度的上升而下降,0.30mg/l Hg²⁺处理组两种ATPase活力分别下降到1.78和1.89μmol Pi/mg蛋白,仅相当于对照组酶活力的1/3左右,表明鳃的功能受到显著影响。水体Hg²⁺对肝胰腺消化酶中的类胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性均有不同程度的抑制,且Hg²⁺浓度越高,抑制作用越明显。然而,Hg²⁺对脂肪酶活性则有浓度依存的增强作用,低浓度增强高浓度抑制其酶活力。水体Hg²⁺对肝胰腺代谢酶活力的影响方式为:随着Hg²⁺浓度的增高,肝胰腺谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）不断下降;而酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活力则呈现出呈先增加后减少的变化趋势。水体Hg²⁺对血淋巴代谢酶活力的影响方式为:随着Hg²⁺浓度的增高,四种选定的代谢酶谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）均呈现出先上升后下降的变化趋势。Sephadex G-75凝胶柱的结果显示,水体Hg²⁺诱导中华绒螯蟹肝胰腺内金属硫蛋白（Metallothionein,MT）合成分子量20,000和11,000左右的金属硫蛋白峰。采用血红蛋白/镉饱和法,测定不同Hg²⁺浓度处理下,肝胰腺金属硫蛋白（MT）含量。结果表明:0.01 mg/l Hg²⁺处理组已诱导金属硫蛋白合成,随着水体中Hg²⁺浓度的增高,0.10 mg/1 Hg²⁺MT含量时达到峰值。综合上述实验结果,水体Hg²⁺对中华绒螯蟹的毒性作用机制可认定为:水体Hg²⁺主要由鳃吸收进入血淋巴,并主要在鳃和肝胰腺为主的组织器官内积累,当Hg²⁺随着血淋巴到达全身各处时,首先对机体的酶和生物大分子的结构和功能产生影响,随着Hg²⁺浓度的增高,对鳃、肝胰腺等组织器官的结构和功能产生了不可逆的损害,影响这些组织的生理机能,进而影响到蟹的生长。本研究初步揭示了水体Hg²⁺对中华绒螯蟹的毒性作用机制。不仅为最终阐明重金属对甲壳动物毒性作用的机制具重要的理论价值,而且为健康养殖和水质监测提供参考数据,同时也为其它重金属相应的研究建立了一套成熟的方法。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-16
第一章水体中重金属对甲壳动物毒性作用研究概况  16-40
  第一节水体中重金属对甲壳动物的急性毒性影响  17-21
  第二节水体中重金属对甲壳动物的亚急性和慢性毒性影响  21-35
    1.2.1 重金属在甲壳动物体内的吸收和积累  21-25
    1.2.2 重金属对甲壳动物生化物质的影响  25-31
    1.2.3 重金属对甲壳动物细胞和组织器官的影响  31-33
    1.2.4 重金属对甲壳动物蜕皮、生长和存活的影响  33-35
  第三节本研究的背景、目的和意义  35-40
    1.3.1 研究背景  35-37
    1.3.2 研究目的和意义  37-38
    1.3.3 研究内容与路线  38-39
    1.3.4 技术路线图  39-40
第二章水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹急性、亚急性毒性及其积累和分布  40-54
  第一节水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹蜕皮、增长和存活的影响  40-47
    2.1.1 材料和方法  40-41
    2.1.2 结果  41-44
    2.1.3 讨论  44-47
  第二节水体Hg~(2+)在中华绒螯蟹体内的积累和分布  47-53
    2.2.1 材料和方法  47-48
    2.2.2 结果  48-50
    2.2.3 讨论  50-53
  第三节本章小结  53-54
第三章水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹细胞和组织器官的影响  54-77
  第一节水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹鳃显微和超微结构的影响  54-67
    3.1.1 材料和方法  54-55
    3.1.2 结果  55-58
    3.1.3 讨论  58-67
  第二节水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹肝胰腺显微和超微结构的影响  67-76
    3.2.1 材料和方法  67
    3.2.2 结果  67-69
    3.2.3 讨论  69-76
  第三节本章小结  76-77
第四章水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹组织生化酶和金属硫蛋白的影响  77-108
  第一节水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹抗氧化酶以及MDA含量的影响  77-87
    4.1.1 材料和方法  78-79
    4.1.2 结果  79-83
    4.1.3 讨论  83-87
  第二节水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹鳃ATPase和肝胰腺消化酶的影响  87-93
    4.2.1 材料和方法  87-89
    4.2.2 结果  89-91
    4.2.3 讨论  91-93
  第三节水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹血淋巴、肝胰腺代谢酶活力的影响  93-99
    4.3.1 材料和方法  93-94
    4.3.2 结果  94-97
    4.3.3 讨论  97-99
  第四节水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹肝胰腺MT合成的影响  99-105
    4.4.1 材料和方法  99-100
    4.4.2 结果  100-102
    4.4.3 讨论  102-105
  第五节本章小结  105-108
    4.5.1 水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹酶活力和金属硫蛋白影响的综合分析  105-106
    4.5.2 结论  106-108
第五章论文总结  108-113
致谢  113-114
参考文献  114-130
个人简历、在学期间发表的论文及获奖情况  130-131

水体Hg~（2+）对中华绒螯蟹毒性作用研究

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