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目的：研究去细胞加光氧化交联处理后牛颈静脉血管片表面改性方法,增加组织工程血管材料内皮细胞的黏附生长。方法：选取新鲜合适的牛颈静脉,采用多步骤去垢剂-酶消化法脱细胞和光氧化交联,经处理后的牛颈静脉脱细胞基质是比较理想的组织工程血管支架。应用纤维连接蛋白(Fibronectin, Fn),Ⅳ型胶原(Collagen, ColⅣ),明胶为单独预衬成分,纤维连接蛋白+明胶,纤维连接蛋白+Ⅳ型胶原+明胶为混合预衬成分,设置磷酸缓冲液体组(PBS)预衬为对照组,每组成分均以30μl的剂量采用物理包裹法,预衬去细胞牛颈静脉血管片54片(裁剪每片面积约1.6cm2)。每片种植人脐静脉内皮细胞株细胞(CRL-2480)5×105,静态培养7天,取1,4,7天标本消化血管片表面细胞记数,标本切片HE染色,扫描电镜和透射电镜检测,比较各处理组血管片表面细胞黏附数目,结合程度,对比不同预处理方法对增强细胞黏附性和促进生长情况的影响,探索最佳组织工程血管改性技术。结果：(1)细胞记数：细胞培养第1天,预衬组细胞数目多于对照组(p<0.05),预衬处理组间无明显差别。第4-7天,混合预衬组与单一预衬组间有差别(p<0.05),混合预衬组内无差别(p>0.05)。(2)标本石蜡包埋后切片HE染色结果：第1天各组血管片表面细胞排列密集,紊乱,细胞核有堆积,部分呈双层排布；第4天,对照组血管表面细胞疏松,有成片分布；预衬组细胞连接成片,呈单层排布。第7天,对照组和单独预衬组细胞都较少,混合预衬组细胞铺连成片,与下方纤维结构有连接,未出现表皮脱落。(3)取7天标本扫描电镜显示：PBS组血管片表面细胞稀疏,细胞间无桥接,与下方的纤维结构联结不明显。混合预衬组铺连成片,细胞间长梭形有桥接和突起,与去细胞的血管片纤维之间形成连接。(4)透射电镜：可观察到表面生长内皮细胞与下方纤维成分有空白带存在。结论：去细胞加光氧化处理后的牛颈静脉血管片可生长内皮细胞。经过Fn, ColⅣ,明胶单独预衬处理的血管片表面,可增强内皮细胞黏附和贴壁生长。混合预衬比单独预衬处理在增强细胞黏附性及贴壁生长方面效果更好。目的：从犬骨髓细胞中分离出骨髓间充质干细胞,提取内皮祖细胞,体外培养分化为内皮细胞,种植到混合预衬去细胞牛颈静脉材料上培养,体外构建组织工程血管。方法：1.使用Ficoll淋巴细胞分离液,通过密度梯度离心法从犬骨髓细胞中分离出单个核细胞,骨髓单个核细胞通过反复贴壁培养法获得内皮祖细胞,CD34抗原染色鉴定；含多种细胞生长因子的内皮细胞培养基培养,促进内皮祖细胞分化为成熟的内皮细胞,CD31和人类Ⅷ因子相关抗原染色鉴定。2.混合预衬材料处理牛颈静脉脱细胞血管材料,将内皮细胞种植到血管材料,体外静态培养7天后,HE染色观察表明细胞覆盖情况及扫描电镜检测血管片上细胞的生长情况。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈螺旋状、放射状生长排列。原代培养的骨髓内皮祖细胞很快形成克隆,第2代细胞中CD34相关抗原的表达阳性率约45%,CD31和Ⅷ因子表现阴性。从第4代细胞起表现出内皮细胞样形态,呈“铺路石”状,并表现接触抑制的特点,第5代细胞CD34相关抗原表达阴性,CD31和Ⅷ因子相关抗原表达的阳性率为78%左右。种植于组织血管表面细胞,HE染色显示细胞覆盖血管表面,扫描电镜检测到血管片上均有较致密的细胞覆盖生长,但细胞排列无序。结论：骨髓来源的间充质干细胞分化为内皮细胞,可种植于脱细胞牛颈静脉血管,构建内皮化组织工程血管。目的：将种植内皮细胞的组织工程血管,用于重建犬右心室流出道实验模型,观察体内组织工程血管与血液接触的条件下的表面内皮化、细胞浸润以及钙化、血栓情况,评价内皮化去细胞牛颈静脉临床应用可行性。方法：以种植分化扩增所获内皮细胞的去细胞牛颈静脉带瓣管道为研究对象,建立犬重建右心室—肺动脉连接的动物模型,设立未种植细胞的去细胞结合光氧化制备的牛颈静脉血管为对照组。实验动物分别于1月、3月和6月屠宰后取出标本,大体观察了解血管形态改变；组织化学和免疫组织化学染色观察各种炎性细胞浸润、表面内皮细胞生长,电镜检查了解植入后的管壁超微结构变化。结果：17只犬除了5只死于手术中室颤外,余12只得以存活,其中对照组和试验组各6头。于1月、3月和6月各宰杀4只,对照组和试验组各2头。大体解剖标本：1月、3月对照组和试验组均无血栓和钙化形成,；6月对照组犬存在血栓沉着和近端吻合口膜样增生,存在血管部分钙化点,试验组均无异常。Ⅷ因子染色显示：1、3、6月时,试验组标本都表现出染色阳性,对照组只有6月的8因子染色结果显示为阳性。von kossa钙盐染色对照组在6月见到明显钙化点,试验组未见钙化点。电镜结果显示：试验组在1月时血管表面细胞部分覆盖,对照组无细胞。3月试验组标本表面细胞铺连成簇,对照组部分覆盖,可见裸露血管。6月试验组可见铺连成片细胞,对照组仍有部分组织工程血管显露。结论：犬骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞后,种植预衬处理后去细胞牛颈静脉血管,在重建右室流出道体内实验中表现出良好生长活性、抗钙化能力和较好内皮化程度。
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