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黄芪甲苷、β-榄香烯抗肝癌作用及其免疫机制的研究

作　者: 林琳
导　师: 沈洪
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 黄芪甲苷 β-榄香烯协同增效作用肝癌免疫机制树突状细胞
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：1.通过体外研究观察黄芪甲苷、β-榄香烯对小鼠肝癌细胞的增殖抑制作用,以及对小鼠巨噬细胞(Mφ)、树突状细胞(DC)免疫功能的影响,同时观察黄芪甲苷与β-榄香烯联用后是否具有增效作用,探讨黄芪甲苷、β-榄香烯对肝癌细胞的增殖是否有抑制作用,同时是否能够增强小鼠Mφ及DC的免疫功能。2.通过体内研究观察黄芪甲苷、β-榄香烯及其联用对小鼠细胞因子IL-2、IFN-y、TNF-α变化的影响,探讨黄芪甲苷、β-榄香烯是否能够增强小鼠机体的免疫功能,同时两者联用是否有增效作用。3.通过体内研究观察黄芪甲苷、β-榄香烯及其联用对肝癌荷瘤小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,并检测实验小鼠的T淋巴细胞表型和脾细胞IFN-γ、IL-4的表达,探讨黄芪甲苷、β-榄香烯对肝癌荷瘤小鼠免疫系统的影响及抗肿瘤作用。方法：体外研究：培养小鼠肝癌细胞株BNL-75,分别用不同浓度黄芪甲苷、β-榄香烯、塞来昔布处理后用CCK-8试剂盒进行细胞生长抑制实验,计算抑制率；培养小鼠Mφ株J447A.1,取对数生长期细胞分空白组(阴性对照)、黄芪甲苷组、β-榄香烯组和联合组(黄芪甲苷+β-榄香烯),收集经药物处理24h后的4组细胞,用流式细胞仪检测细胞表面MHCⅡMHCⅠ、CD40、CD86的表达,ELISA法检测细胞上清中TNF-α、IL-1β含量,Griess方法检测细胞上清NO的表达；体外培养小鼠DC株D2SC,取对数生长期细胞分空白组、脂多糖(LPS)组、黄芪甲苷组、β-榄香烯组和联合组(黄芪甲苷+β-榄香烯),收集经药物处理24h后的5组细胞,用流式细胞仪检测细胞表面MHCⅡMHCⅠ, CD40、CD80、CD86的表达,ELISA法检测细胞表面IL-6、IL-12的表达。体内研究：C57小鼠随机分为黄芪甲苷组,β-榄香烯组,黄芪甲苷组+β-榄香烯组,空白对照组,每组6只,每日一次灌胃,空白对照组给予生理盐水,每次500μl；黄芪甲苷组,β-榄香烯组,黄芪甲苷组+β-榄香烯组给予相应药液,每次各组给药浓度1OOμg/ml,500μ1,分别在给药第7、14、21天小鼠眼球后静脉取血离心,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ, TNF-α的含量；建立肝癌皮下移植瘤模型,取建瘤成功的24只肝癌荷瘤小鼠,随机分为黄芪甲苷组,β-榄香烯组,黄芪甲苷组+β-榄香烯组,空白对照组,每组6只,予建瘤成功次日连续每日一次灌胃,空白对照组给予生理盐水,每次500μl；黄芪甲苷组,β-榄香烯组,黄芪甲苷组+β-榄香烯组给予相应药液,每次各组给药浓度100μg/ml,500μl,连续给药15天,具体分组为：空白对照组(正常小鼠)、实验对照组(荷瘤小鼠)、实验组(黄芪甲苷、β-榄香烯灌胃后的荷瘤小鼠),观察肿瘤生长情况,停药次日处死取脾,流式细胞仪检测脾细胞CD4、CD8的表达。结果：体外研究：黄芪甲苷、β-榄香烯对肝癌肿瘤细胞生长有明显抑制作用,同时两者联用具有协同增效作用。与空白组相比,黄芪甲苷、β-榄香烯处理后Mφ表面MHCⅡMHCⅠ、CD40、CD86分子的表达水平均显著提高(p<0.01,p<0.05),其中联合处理后MHCⅡ、CD40、CD86表达明显高于黄芪甲苷组(p<0.05), MHCⅠ表达明显高于β-榄香烯组(p<0.05)。随着黄芪甲苷、β-榄香烯浓度及作用时间的增加,Mφ吞噬中性红的能力逐渐升高,100μ/ml的浓度作用24h后吞噬能力最佳,两者联用时有协同增效作用。不同浓度黄芪甲苷、β-榄香烯处理后Mφ上清TNF-α, IL-1β、NO的表达水平均高于空白组,100μg/ml浓度时有统计学意义(p<0.01,p<0.05),且各组表达水平均随着加药浓度的增加而提高；同一浓度联合组表达TNF-α, IL-1β、NO均高于单用中药组,黄芪甲苷组与β-榄香烯组无明显差别；与单用黄芪甲苷或单用β-榄香烯相比,100μg/ml浓度的联用组TNF-α、IL-1β、NO的表达明显升高(p<0.05)。与空白组、LPS组比较,黄芪甲苷、β-榄香烯及其联合处理后的D2SC细胞表面MHCⅡ、MHCⅠ、CD40、CD80、CD86分子的表达水平均显著提高(p<0.01,p<0.05);与单用黄芪甲苷或单用β-榄香烯相比,黄芪甲苷与β-榄香烯联合处理后MHCⅡ、MHCⅠ、CD40、CD80、CD86分子表达水平明显升高,部分有统计学意义(p<0.05)。黄芪甲苷、β-榄香烯处理后的D2SC细胞表面细胞因子IL-12、IL-6的表达水平均高于空白组与LPS组,其中黄芪甲苷组、β-榄香烯组处理后IL-12、IL-6表达明显高于LPS组(p<0.05),联合组处理后IL-12、IL-6表达显著高于LPS组(p<0.01)；与单用黄芪甲苷组或单用β-榄香烯相比,黄芪甲苷、β-榄香烯联合处理后IL-12、IL-6表达明显升高(p<0.05)。体内研究：黄芪甲苷、β-榄香烯及联合灌胃后小鼠体内IL-2、IFN-γ、TNF-α的表达水平明显高于空白组(p<0.01,p<0.05),且各组表达水平均随着灌胃天数的增加而提高；与单用黄芪甲苷或单用β-榄香烯灌胃相比,联合组小鼠灌胃后第21天体内IL-2、IFN-γ、TNF-α的表达明显升高(p<0.05)。黄芪甲苷、β-榄香烯对肝癌荷瘤小鼠灌胃15天后,3组实验组小鼠皮下肿瘤生长趋势较生理盐水组明显缓慢,联合组在灌胃10天后肿瘤缩小趋势更加明显。与空白对照组比较,实验对照组及实验组小鼠T细胞数量均有明显下降;与实验对照组比较,实验组小鼠T细胞数量明显增多,与单个中药组比较,联合组小鼠T细胞数量增多。荷瘤小鼠经中药治疗后,CD4+/CD8+比例增高,联合用药组显著增高,CD4+/CD8+>1(P<0.05)。中药治疗后荷瘤小鼠脾细胞IFN-γ、IL-4的表达水平均高于对照组,其中黄芪甲苷组、β-榄香烯组IFN-γ、IL-4表达明显高于对照组(p<0.05),联合组IFN-γ、IL-4表达显著高于对照组(p<0.01)；与单用黄芪甲苷组或单用β-榄香烯治疗相比,黄芪甲苷、β-榄香烯联合治疗荷瘤小鼠后IFN-γ, IL-4表达明显升高(p<0.05)。结论：1、黄芪甲苷、β-榄香烯对肝癌细胞的生长有明显抑制作用,对肝癌荷瘤小鼠有明显抑瘤作用,同时两者联用有协同增效作用。2、黄芪甲苷、β-榄香烯可能是通过刺激活化Mφ、促进DC成熟、促使多种免疫相关细胞因子高表达等多途径增强机体细胞及体液免疫功能,进而发挥抗肿瘤作用,同时两者联用有协同增效作用。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-15
第一部分理论研究  15-29
  一中医对肝癌病机的认识  15-16
  二益气活血法抗肿瘤的作用机制  16-18
  三机体抗肿瘤免疫的机制  18-19
  四巨噬细胞的生物学特性以及中药对巨噬细胞免疫调节作用的研究  19-22
  五树突状细胞的生物学特性以及功能  22-26
  六与肿瘤相关的细胞因子  26-29
第二部分体外研究  29-51
  实验一黄芪甲苷 β-榄香烯对小鼠肝癌细胞BNL-75增殖抑制作用的研究  29-33
    1 材料  29-30
    2 方法  30
    3 统计学处理  30
    4 结果  30-31
    5 小结  31-33
  实验二黄芪甲苷 β-榄香烯增强小鼠Mφ功能的研究  33-44
    1 材料  33-34
    2 方法  34-35
    3 统计学处理  35
    4 结果  35-42
    5 小结  42-44
  实验三黄芪甲苷 β-榄香烯增强小鼠DC免疫功能的研究  44-51
    1 材料  44-45
    2 方法  45-46
    3 统计学处理  46
    4 结果  46-49
    5 小结  49-51
第三部分体内研究  51-65
  实验四黄芪甲苷 β-榄香烯对小鼠体内细胞因子的影响  51-57
    1 材料  51
    2 方法  51-52
    3 统计学处理  52
    4 结果  52-55
    5 小结  55-57
  实验五黄芪甲苷 β-榄香烯对肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及其免疫功能的影响  57-65
    1 材料  57-58
    2 方法  58-59
    3 统计学处理  59
    4 结果  59-63
    5 小结  63-65
第四部分讨论  65-69
  一前期研究结果以及黄芪甲苷 β-榄香烯对肝癌细胞的增殖抑制作用  65
  二黄芪甲苷 β-榄香烯对肿瘤免疫相关细胞及因子的影响  65-67
  三黄芪甲苷 β-榄香烯对肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫相关细胞因子的影响  67
  四研究结论  67-68
  五问题与展望  68-69
参考文献  69-75
附录  75-76
攻读博士学位期间取得的研究成果  76-77
致谢  77-78
作者简介  78-79
文献综述1  79-85
  参考文献  82-85
文献综述2  85-91
  参考文献  89-91

黄芪甲苷、β-榄香烯抗肝癌作用及其免疫机制的研究

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