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白血病靶向治疗与耐药逆转机制研究

作　者: 张砚君
导　师: 熊冬生
学　校: 北京协和医学院
专　业: 肿瘤药理学
关键词: CD123 白介素3 力达霉素急性髓系白血病干细胞蛋白改造 Ca+拮抗剂多药耐药 G2/M期阻滞 cdc2/p34
分类号: R733.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的白细胞介素3受体α链(IL-3Rα链)即CD123抗原,是特异识别并结合白细胞介素3(IL-3)的关键部位,在急性髓系白血病(AML)干细胞表面高表达,同时在正常造血干细胞表面几乎不表达。力达霉素是烯乙二炔家族的一个新成员,主要由辅基蛋白和发色团两部分组成,可以拆分和重组,是一种新型高效的细胞毒药物,已经进入Ⅱ期临床。本实验,希望结合二者的靶向和高效杀伤优势,制备一种能够针对AML干细胞的新型有效药物。方法利用DNA重组方法构建了一个以CD123为靶点、力达霉素为弹头药物的融合蛋白IL3-LDM,并采用蛋白质谱与基因工程相结合的方法对其稳定性进行鉴定和优化改造,构建mIL3-LDM。通过IPTG诱导表达得到可溶性蛋白后,经HIS6镍柱纯化,通过SDS-PAGE(?)(?)western blot鉴定蛋白特性,通过BCA定量和IL3 ELISA定量确定蛋白产量及纯度。流式细胞术(FACS)、荧光显微镜和激光共聚焦确定融合蛋白与CD123+的细胞系及病人临床标本的结合活性后,CCK-8检测该蛋白的细胞系杀伤效果,克隆形成实验检测病人临床标本的干细胞杀伤率。结果经改造后的融合蛋白mIL3-LDM,稳定性提升同时最大限度的保留了两部分的全部活性。纯化后的蛋白mIL3-LDM表达量约为1mg/l,纯度可达95%,FACS测定融合蛋白与靶细胞的结合活性与CD123表达阳性率成正比。体外,无论是细胞系还是AML病人细胞标本,mIL3-LDM对CD123+的细胞系及AML干细胞均有很强的靶向杀伤活性,作用要明显强于单纯的LDM,对TF-1和M07e细胞的IC50值分别是0.9和1.2 nM,是LDM的1/300和1/200。mIL3-LDM融合蛋白的杀伤机制研究也显示与LDM一致,充分证明了该蛋白的靶向与杀伤活性与预期相符。结论体外实验证实,mIL3-LDM融合蛋白提供了一种治疗AML的新思路,其仅针对病人体内干细胞、不伤害其他正常干细胞的优势为制作新型抗肿瘤药物提供了一个很好的技术平台。目的P-gp高表达是肿瘤细胞产生耐药的重要机制之一,人们致力寻找一种有效安全的逆转剂,本实验对EBB逆转P-gp耐药的机制进行研究。方法MTT检测了不同浓度EBB对耐药细胞系MCF-7/ADR的逆转效果,流式细胞术检测了细胞经EBB处理后的P-gp表达改变,荧光显微镜下观察由此引起的Rh123和阿霉素的细胞内累积。Fluo-3检测了EBB对细胞内Ca2+浓度的影响,流式细胞术检测了EBB对细胞凋亡和周期变化的作用,Western Blot确定了周期相关蛋白的表达量变化。结果实验发现,与传统耐药逆转剂VPL相比,EBB可以更有效提升DOX耐药细胞的化疗敏感性,它不仅能下调P-gp在细胞表面表达,还能通过阻断P-gp功能提高药物和Rhl23在细胞内有效浓度。此外还发现,EBB通过下调细胞周期蛋白cdc2/p34和cyclin B1,提高细胞内Ca+浓度来实现EBB与DOX联合应用时引起的MCF-7/ADR细胞G2M周期阻滞及凋亡。结论EBB可以有效改善细胞对DOX的耐药性,成为应用于临床癌症治疗的新型逆转剂。

全文目录

第一部分 LI3靶向融合蛋白的结构改造、表达及活性研究  4-80
  摘要  4-5
  Abstract  5-6
  前言  6-9
  实验材料  9-11
  实验方法  11-38
  结果  38-70
  结论  70
  讨论  70-75
  参考文献  75-80
第二部分 EBB逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADR耐药作用研究  80-105
  摘要  80-82
  Abstract  82-84
  前言  84-86
  实验材料  86
  实验方法  86-91
  实验结果  91-100
  结论  100
  讨论  100-102
  参考文献  102-105
综述  105-119
  References  113-119
附录  119-128
致谢  128-130

白血病靶向治疗与耐药逆转机制研究

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