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多药耐药铜绿假单胞菌耐药机制的研究

作　者: 彭咏麟
导　师: 吴爱武
学　校: 广州医学院
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 多药耐药铜绿假单胞菌外排泵氰氯苯腙纸片扩散法琼脂稀释法 Ⅰ类整合子限制性片段长度多态性外膜蛋白OprD2基因 AmpC酶基因金属酶基因氨基糖苷类修饰酶基因 PCR 多重PCR
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA),是一种重要的医院内感染病原菌,为条件致病菌。由于铜绿假单胞菌具有先天和后天的多药耐药性,对各种抗生素的耐药率不断上升,从而导致其引起的医院感染性疾病治疗越来越困难。本研究通过对临床标本分离的铜绿假单胞菌的耐药特点进行分析,检测其主动外排泵,初步探讨主动外排泵在该菌耐药中的作用;同时也对临床分离的32株多药耐药铜绿假单胞菌的耐药特点进行分析,进一步检测其外膜蛋白oprD2基因、β-内酰胺酶相关基因、氨基糖苷类耐药基因、整合酶基因及其整合子携带的耐药基因盒等,以期从整体上了解多药耐药铜绿假单胞菌的耐药规律以及其耐药基因在菌株间水平传播的特点,从而为临床上合理使用抗生素提供参考。方法1.铜绿假单胞菌临床分离株主动外排泵的检测与分析收集2008年9月—2009年9月广州医学院第一附属医院临床标本中分离到的60株铜绿假单胞菌,采用K-B法检测铜绿假单胞菌临床分离株对9种常用抗生素(庆大霉素、氨曲南、头孢他啶、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、多粘菌素B)的耐药情况;通过外排泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)对四种药物(羧苄青霉素、红霉素、亚胺培南、庆大霉素)的琼脂稀释法抑制试验分别检测铜绿假单胞菌四种外排泵(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY- OprM)的表型;同时应用PCR方法检测MexAB-OprM外排泵调节基因mexR的变异情况。2.多药耐药铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子及其耐药基因盒的检测与分析收集2008年—2010年广州医学院第一附属医院临床分离标本中分离的32株多药耐药铜绿假单胞菌(multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDRP),通过PCR方法检测其整合酶基因(integrase)和Ⅰ类整合子遗传标志物qacEΔ1-sull基因以分析其整合子类型;通过对整合子的可变区耐药基因盒的检测和对其可变区PCR产物进行限制性片段长度多态性分析来了解其耐药基因的携带情况。3.多药耐药铜绿假单胞菌株外膜蛋白oprD2基因、β-内酰胺酶相关基因和氨基糖苷类耐药基因的检测与分析对32株多药耐药株采用K-B纸片法检测其对8种常用抗生素(氨曲南,环丙沙星,头孢吡肟,庆大霉素,亚胺培南,氨苄西林,复方新诺明,哌拉西林/他唑巴坦)的耐药水平;通过PCR方法检测外膜孔蛋白oprD2基因以分析其缺失情况;通过PCR检测B类金属酶相关基因NDM-1、IMP、GIM、VIM、SPM、GES、KPC型基因了解B类金属酶的产生情况;通过PCR检测氨基糖苷类耐药基因以了解它在多药耐药株耐药中的作用;通过多重PCR检测OXA型β-内酰胺酶基因和质粒型AmpC酶基因,了解相应酶的存在情况。结果1. 60株铜绿假单胞菌临床分离株对9种常用抗生素的耐药率依次为:庆大霉素36.67%(22/60),氨曲南33.33%(20/60),头孢他啶31.67%(19/60),亚胺培南28.33%(17/60),阿米卡星26.67%(16/60),哌拉西林/他唑巴坦23.33%(14/60),环丙沙星21.67%(13/60),左氧氟沙星11.67%(7/60),多粘菌素B为0;外排泵表型阳性株依次为:MexAB-OprM 35株,阳性率58.33%(35/60);MexXY-OprM13株,阳性率21.67%(13/60);MexCD-OprJ 11株,阳性率18.33%(11/60);MexEF-OprN 10株,阳性率16.67%(10/60)。35株MexAB-OprM外排泵表型阳性株中有28株扩增出mexR基因片段,检出率80.0%(28/35)。2. 32株MDRP中有5株可扩增出整合酶基因,其阳性菌株中有4株qacEΔ1-sull基因扩增阳性。在4株Ⅰ类整合子可变区中扩增出耐药基因的有3株。通过对可变区基因盒的耐药基因分析(Blast比对),发现2种形式的耐药基因组合:①aadB—blaPSE-1,其中aadB编码氨基糖苷类药物如庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐药,blaPSE-1属于β内酰胺类耐药基因,编码对头孢类抗生素的耐药;②aadB—aac(6ˊ)-Ⅱa—blaPSE-1,其中aac(6ˊ)-Ⅱa编码阿米卡星、奈替米星和妥布霉素的耐药。3. 32株MDRP对8种常用抗生素的耐药率:复方新诺明100%,氨苄西林96.88%,氨曲南87.50%,头孢吡肟62.50%,环丙沙星62.50%,亚胺培南59.38%,哌拉西林/他唑巴坦56.25%,庆大霉素31.25%。32株MDRP中有26株缺失oprD2基因,缺失率占81.25%(26/32)。B类金属酶NDM-1、IMP、GIM、VIM、SPM、GES、KPC型基因在32株MDRP中的PCR检测结果均为阴性。氨基糖苷类耐药基因在32株MDRP中的PCR检测结果:有7株MDRP菌株检出氨基糖苷类耐药基因(检出率为21.86%,7/32),其中4株aac(6′)-Ⅱ基因扩增产物阳性,4株ant(2′′)-Ⅰ基因扩增产物阳性,而14号标本同时含有aac(6′)-Ⅱ基因和ant(2′′)-Ⅰ基因。同源性比对,BLAST结果显示:aac(6′)-Ⅱ基因扩增产物与登录号为HQ880255.1和HQ880250.1的铜绿假单胞菌的aac(6′)-Ⅱ基因同源性为100%,ant(2′′)-Ⅰ基因扩增产物和登录号为JF742758.1的ant(2′′)-Ⅰ基因同源性为100%。多重PCR对OXA型β-内酰胺酶基因和质粒型AmpC酶基因的检测:21号标本OXA23基因PCR扩增产物阳性,29号标本OXA51基因PCR扩增产物阳性。同源性比对,BLAST结果显示:21号标本PCR扩增产物与登录号为JF421124.1、CP002522.1和HQ008358.1等的鲍曼不动杆菌的OXA23基因同源性为99%;29号标本PCR扩增产物与登录号为CP002522.1的鲍曼不动杆菌的产D型β-内酰胺酶基因同源性为100%,与登录号为HQ222987.1的鲍曼不动杆菌的OXA51基因同源性为99%。质粒型AmpC酶基因的多重PCR扩增产物均为阴性。结论1.在临床常用抗生素中,铜绿假单胞菌临床分离株对庆大霉素的耐药率最高,对多粘菌素B耐药率最低。4种外排泵表型中最常见的是MexAB-OprM ,它的存在可能是铜绿假单胞菌多药耐药的重要机制。2.多药耐药铜绿假单胞菌整合子的分布类型以Ⅰ类整合子为主。整合子中的氨基糖甙类修饰酶基因和β-内酰胺类基因的存在与多药耐药铜绿假单胞菌的多药耐药密切相关。3.多药耐药铜绿假单胞菌对磺胺类药物全部耐药,对β-内酰胺类抗生素的耐药率较高(均在50%以上),对氨基糖苷类抗生素耐药率相对较低,在临床上可以考虑以此类药物作为曾经接受大量广谱抗生素治疗的患者抗感染治疗联合用药的一种选择。外膜蛋白OprD2的缺失、β-内酰胺酶和氨基糖苷类耐药基因的存在,与铜绿假单胞菌的多药耐药密切相关。

全文目录

中、英文缩写对照  4-6
中文摘要  6-10
Abstract  10-15
前言  15-19
第一部分铜绿假单胞菌临床分离株主动外排泵的检测与分析  19-26
  1 材料和方法  19-21
  2 结果  21-23
  3 讨论  23-26
第二部分 MDRP 菌株Ⅰ类整合子及其耐药基因盒的检测与分析  26-38
  1 材料和方法  26-29
  2 结果  29-35
  3 讨论  35-38
第三部分 MDRP 菌株 oprD2 基因、β-内酰胺酶相关基因和氨基糖苷类耐药基因的检测与分析  38-51
  1 材料和方法  38-43
  2 结果  43-47
  3 讨论  47-51
结论  51-52
参考文献  52-58
综述  58-70
  参考文献  65-70
致谢  70-71

多药耐药铜绿假单胞菌耐药机制的研究

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