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胶孢炭疽菌侵染柿树的细胞学研究及CGTA1基因的克隆

作　者: 李明江
导　师: 张敬泽
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理
关键词: 柿树胶孢炭疽菌细胞学基因克隆热不对称交错PCR(TAIL-PCR)
分类号: S436.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

柿树炭疽病在全世界产柿国家均有发生。近年来,在浙江淳安地区无核柿(Diospyros kaki cv.Wuheshi)上柿树炭疽病发病严重,给当地柿树产业发展造成了严重损失,成为可持续发展的瓶颈;侵染无核柿的炭疽菌是由胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)引起的。病原菌侵染柿树枝条互作过程中,也发现柿树炭疽菌也具有两种营养阶段,初生菌丝可穿透寄主细胞壁从一个细胞进入另一个细胞,并且在寄主互作界面上也形成界面基质,非常相似于菜豆炭疽菌侵染寄主的细胞学特征。炭疽菌为了侵入寄主组织,采用各种侵染策略,提供了研究真菌致病性的分子和细胞学极好的模式。本文主要说明叶柄和枝条在不同的发育阶段对炭疽病发生和发展的影响,从细胞学水平上揭示成熟组织抗病的机制;为了说明胶孢炭疽菌活体营养向死体营养的转换机制,并克隆了胶孢炭疽菌CGTA1。1、柿树器官发育对炭疽病发生的影响通过人工接种柿树炭疽菌在不同发育时期的无核柿叶柄和枝条,证明感病的无核柿叶柄和枝条随着发育对炭疽病抗性增强,主要表现为病害潜育期延长,第3次接种(5月25日)比第1次接种(4月15日)在叶柄上病害潜育期延长52h,在枝条上可推迟40h。侵染过程的细胞学研究表明,接种72h后,在成熟叶柄中当大的初生菌丝在穿透寄主细胞壁时变细,然后直接穿透寄主细胞壁,又形成膨大的初生菌丝,并从初生菌丝上产生次生菌丝。比较原先的研究结果认为,叶柄发育影响了炭疽菌从活体营段向死体营养阶段的转化,使活体营养存在时间延长,从而也使病害潜育期延长。2、胶孢炭疽菌CGTA1基因的克隆:根据菜豆炭疽的CLTA1基因及其同源真菌锌簇转录因子基因的分析,设计简并引物,扩增胶胞炭疽基因组DNA获得一个长度为687bp的基因片段。该基因片段与CLTA1基因对应序列相比,大小仅相差两个碱基,同源性为67.24%,说明获得片段是目的基因片段。根据该基因片段设计嵌套的特异引物,用TAIL-PCR方法从胶孢炭疽菌基因组DNA中扩增该基因片段两端侧翼序列,获得2844bp基因序列。序列分析表明,该序列是目的基因CGTA1序列,该序列中包含2514bp的完整阅读框,5’端非编码区130bp,3’端非编码区200bp。该基因与同源基因CLTA1基因的阅读框具有65.1%的同源性。BLAST搜索比对认为,该基因同源于真菌锌簇转录因子基因。

全文目录

致谢  4-10
摘要  10-12
Abstract  12-14
第一章文献综述  14-41
  第一节柿树炭疽菌研究进展  14-18
    1 柿树炭疽菌病害的危害性  14-15
    2 炭疽菌侵染策略及与寄主互作的细胞学特征  15-16
      2.1 细胞内半活体营养侵染型(Intracellular Hemibiotrophic Infections)  15-16
      2.2 角质层下内部侵染型(Subcuticular intramural Infections)  16
    3 胶孢炭疽菌中可能存在CLTA1的同源基因  16-18
  第二节真菌转录因子家族—锌指蛋白  18-25
    1 锌指蛋白的分类  18-19
    2 真菌锌簇蛋白  19
    3.锌簇蛋白的结构和功能区域  19-21
    4 锌簇蛋白的结合基元及与DNA结合的特异性  21-22
    5 锌簇蛋白的角色  22-23
    6 丝状真菌中的锌簇蛋白  23-24
    7 锌簇蛋白的重要意义  24-25
  第三节真菌基因克隆及其功能分析  25-40
    1 真菌基因克隆方法  25-35
      1.1 同源序列PCR扩增技术  25-26
      1.2 TAIL-PCR  26-29
        1.2.1 TAIL-PCR技术的原理  27-28
        1.2.2 TAIL-PCR的优点以及不足  28-29
      1.3 RACE  29-32
        1.3.1 RACE的基本原理  29-31
        1.3.2 RACE技术的优点和不足  31-32
      1.4 反向PCR(IPCR)  32-35
        1.4.1 反向PCR技术的发展及应用  33-34
        1.4.2 影响反向PCR扩增的关键因素和条件  34-35
    2 基因功能研究方法  35-40
      2.1 限制酶介导转化(REMI)  35-37
      2.2 农秆菌介导的转化(ATMT)  37
      2.3 目标基因断裂法  37-40
  第四节胶孢炭疽菌细胞学侵染和其转录激活因子(CGTA1)基因研究的目的和意义  40-41
第二章柿树炭疽菌侵染柿树细胞学研究  41-46
  1 材料和方法  41-42
    1.1 试验菌株和培养条件  41
    1.2 柿树栽培  41-42
    1.3 接种  42
    1.4 细胞学显微观察  42
  2 结果  42-45
    2.1 组织发育对病害发生的影响  42-43
    2.2 侵染过程的细胞学观察结果  43-45
  3.讨论  45-46
    3.1 柿树对炭疽病的抗性表现  45
    3.2 柿树炭疽菌侵染不同发育时期叶柄的细胞学  45-46
第三章胶孢炭疽CGTA1基因的克隆  46-78
  第一节 CGTA1基因片段的克隆  46-63
    1 材料、设备和培养基  46-48
      1.1 试剂  46
      1.2 试验设备  46-47
      1.3 菌株  47
      1.4 培养基及抗生素  47
      1.5 抽提缓冲液的配制  47-48
      1.6 质粒抽提缓冲液的配制  48
    2.方法  48-55
      2.1 简并引物设计  48-49
        2.1.1 CLTA1基因保守序列的确定  48-49
        2.1.2 设计目的基因简并引物  49
      2.2 菌株的培养及收集  49
      2.3 真菌基因的提取组  49-50
      2.4 基因片段的扩增  50
      2.5 目的片段的回收  50-51
      2.6 目的片段与pMD-18T载体的连接  51-52
      2.7 重组质粒转化  52-53
        2.7.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  52
        2.7.2 转化  52-53
      2.8 重组质粒的鉴定  53-54
        2.8.1 重组质粒的筛选选—蓝/白斑筛选  53
        2.8.2 质粒抽提  53-54
        2.8.3 菌落PCR  54
      2.9 序列分析软件及网站  54-55
    3.结果与分析  55-61
      3.1 扩增CLTA1基因片段简并引物设计  55-57
        3.1.1 CLTA1基因的结构特征  55-56
        3.1.2 CLTA1基因同源性分析及简并引物  56-57
      3.2 CGTA1基因片段的克隆  57-59
        3.2.1 CGTA1基因的片段的扩增  57-58
        3.2.2 菌落PCR鉴定  58-59
      3.3 PCR产物的测序结果及序列分析  59-61
        3.3.1 序列测定结果  59
        3.3.2 CGTA1基因片段和CLTA1基因序列的比对分析  59-60
        3.3.3 CGTA1基因片段同源性分析  60-61
    4 讨论  61-63
  第二节 CGTA1基因片段侧翼序列的克隆  63-78
    1 材料与方法  63-65
      1.1 试剂和材料  63
      1.2 实验仪器  63
      1.3 菌丝培养及基因组DNA的提取  63
      1.4 TAIL-PCR引物的设计、反应体系和反应程序  63-65
      1.5 TAIL-PCR扩增片段的连接转化  65
      1.6 重组质粒的鉴定  65
      1.7 目的片段的序列测定及序列分析  65
    2 结果与分析  65-75
      2.1 侧翼序列的扩增  65-73
        2.1.1 687 bp片段3'端侧翼序列的扩增  65-68
        2.1.2 687 bp片段5'端侧翼序列的扩增  68-70
        2.1.3 1134 bp片段3'端侧翼序列扩增  70-73
      2.2 基因片段比较、编辑和序列分析  73-75
    3 讨论  75-78
参考文献  78-89

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