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高效发酵木糖生产乙醇酵母菌株的构建

作　者: 李洁
导　师: 赵心清；白凤武
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 休哈塔假丝酵母 酿酒酵母 原生质体融合 基因组改组 乙醇发酵
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 341次
引　用: 2次
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内容摘要


本文从三株木糖发酵菌出发,对发酵培养基进行优化,选取木糖50 g·L-1,蛋白胨3g·L-1,酵母粉3 g·L-1,转速为100 r·min-1微好氧环境进行发酵,通过菌种性能鉴定,选择了性状较为优良的休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）作为木糖发酵的出发菌株。为了改善木糖发酵酵母的性状,进一步通过乙醇驯化,增强休哈塔假丝酵母的乙醇耐性,进而进行呼吸缺陷型的筛选,提高休哈塔假丝酵母的木糖发酵能力。利用改良过的休哈塔假丝酵母做为亲本,与发酵性能优良的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行属间原生质体融合。采用单亲灭活法对休哈塔假丝酵母原生质体进行紫外灭活,在聚乙二醇（PEG）诱导下融合。对得到的融合子进行木糖发酵能力测定,筛选到了一株木糖发酵性能比亲本得到明显提高的融合子F-6,此融合子发酵50 g·L-1木糖,最高乙醇浓度达到18.75 g·L-1,乙醇得率为0.375,达到理论转化值的73.4%。与原始出发菌株相比,乙醇产量提高了28%。在模拟纤维素酸水解液的成分比例的葡萄糖和木糖的混合糖中进行发酵,对比融合子与亲本的总糖和木糖消耗情况,融合子F-6的发酵速率优于亲株,发酵周期比亲本株缩短了6h。为有效利用木质纤维素为原料生产燃料乙醇奠定了良好的基础。本研究结果表明,在木糖发酵乙醇的过程中,亲本假丝酵母的乙醇耐性和木糖发酵性能的提高对后续获得乙醇发酵性能高的融合株是十分必要的。为了进一步采用基因组改组的方法提高休哈塔假丝酵母的木糖发酵能力,构建了休哈塔假丝酵母的正向突变体库,获得了耐18%（v/v）乙醇冲击,耐400 g·L-1葡萄糖及耐250 g·L-1木糖的突变酵母菌株,以及35℃下正常生长的休哈塔假丝酵母菌株,为进行基因组改组提供了菌种基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-11
引言  11-12
1 木质纤维素的综合利用  12-29
  1.1 背景介绍  12-13
  1.2 木质纤维素  13-16
    1.2.1 木质纤维素组成  13-14
    1.2.2 木质纤维素水解预处理  14-16
  1.3 发酵木糖菌株  16-19
    1.3.1 自然界中的木糖发酵菌  16-18
    1.3.2 木糖代谢工程菌  18-19
  1.4 原生质体融合技术(Protoplast fusion)  19-24
    1.4.1 原生质体融合技术的研究进展  20
    1.4.2 原生质体融合技术的原理  20-22
    1.4.3 原生质体的灭活技术  22-23
    1.4.4 原生质体融合的应用  23-24
  1.5 基因组改组(Genome shuffling)  24-27
    1.5.1 DNA改组技术  24-25
    1.5.2 基因组改组  25-27
  1.6 本论文研究的目标  27-29
2 实验材料及方法  29-38
  2.1 材料与方法  29-31
    2.1.1 菌种  29
    2.1.2 培养基  29-30
    2.1.3 试剂  30-31
    2.1.4 培养方法  31
  2.2 仪器与分析方法  31-32
    2.2.1 仪器  31-32
    2.2.2 分析方法  32
  2.3 菌种考察  32-33
    2.3.1 木糖培养状况  32
    2.3.2 同化碳源能力  32
    2.3.3 耐高糖、高温能力  32
    2.3.4 乙醇冲击  32-33
    2.3.5 木糖发酵测定  33
  2.4 休哈塔假丝酵母与酿酒酵母的原生质体融合  33-35
    2.4.1 乙醇驯化  33-34
    2.4.2 呼吸缺陷型筛选  34
    2.4.3 原生质体的制备  34
    2.4.4 融合方法  34-35
  2.5 融合子生理生化特征分析  35
    2.5.1 融合子细胞形态及大小鉴定  35
    2.5.2 融合子DNA含量及倍数的鉴定  35
  2.6 融合子发酵测定  35-36
    2.6.1 融合子产气实验  35-36
    2.6.2 融合子发酵测定  36
    2.6.3 混合糖发酵  36
  2.7 基因组改组  36-38
    2.7.1 突变体文库的构建  36
    2.7.2 基因组改组策略  36-38
3 木糖发酵菌的菌种选择  38-49
  3.1 引言  38
  3.2 实验材料与方法  38-40
    3.2.1 菌种  38
    3.2.2 培养基  38
    3.2.3 培养方法  38-39
    3.2.4 分析方法  39-40
  3.3 结果与讨论  40-47
    3.3.1 生长曲线  40
    3.3.2 同化碳源实验  40-41
    3.3.3 高渗高温实验  41-42
    3.3.4 乙醇冲击实验  42
    3.3.5 发酵实验  42-44
    3.3.6 1766发酵条件优化  44-47
  3.4 小结  47-49
4 原生质体融合法构建木糖发酵乙醇优良酵母  49-60
  4.1 引言  49
  4.2 材料与方法  49-50
    4.2.1 菌种  49-50
    4.2.2 培养基  50
    4.2.3 试剂  50
    4.2.4 实验方法  50
  4.3 结果与讨论  50-58
    4.3.1 休哈塔假丝酵母改良及发酵性能测定  50-52
    4.3.2 原生质体融合  52-53
    4.3.3 融合子的鉴定与分析  53-54
    4.3.4 融合子与亲本发酵性能的比较  54-58
  4.4 小结  58-60
5 休哈塔假丝酵母基因组改组文库的构建  60-64
  5.1 引言  60
  5.2 材料与方法  60-62
    5.2.1 菌种  60-61
    5.2.2 培养基  61
    5.2.3 紫外诱变  61
    5.2.4 耐乙醇冲击酵母筛选  61
    5.2.5 耐高温酵母筛选  61
    5.2.6 耐高糖酵母筛选  61
    5.2.7 耐水解液毒性酵母筛选  61
    5.2.8 呼吸缺陷型  61-62
    5.2.9 基因组改组方法  62
  5.3 结果与讨论  62-63
  5.4 小结  63-64
结论  64-65
创新点与工作展望  65-66
  创新点  65
  工作展望  65-66
参考文献  66-71
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  71-72
致谢  72-73

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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