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分子伴侣Jiv90的原核表达及其功能的初步研究

作　者: 杨幼聪
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 分子伴侣 Jiv90 原核表达 功能研究
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
引　用: 1次
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内容摘要


分子伴侣(molecular chaperones)是一组从细菌到人广泛存在的蛋白质,非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合,并帮助它们折叠和转运,通常不参与靶蛋白的生理功能。Lackner等人发现,宿主细胞的分子伴侣Jiv90蛋白与CSFV具有自身蛋白酶活性的NS2蛋白相互作用,然后把NS2-3蛋白复合体切割成NS2和NS3蛋白单体。虽然对Jiv90基因的研究有一些报道但只是局限于与病毒的相互作用和对病毒滴度的影响,对Jiv90蛋白的功能研究鲜有报道。本文以揭示Jiv90蛋白的功能为目标,开展了Jiv90基因的原核表达、Jiv90蛋白的降解特性、Jiv90基因的细胞组织分布情况等方面的研究,取得了如下的研究结果。(1)根据Gene Bank上已发表的牛的Jiv90基因序列,设计特异的引物,应用RT-PCR技术扩增猪的Jiv90基因,将其定向插入到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Jiv90,Western-blot分析,经IPTG诱导后在大肠埃希菌中成功表达了分子质量约45ku的重组蛋白。(2) Jiv90基因与绿色荧光蛋白报告基因进行融合表达,Western blot分析发现Jiv90的融合蛋白的分子质量约为52 ku,该蛋白通过蛋白酶体途径降解,这一降解过程可以被特异性的蛋白酶体抑制剂MG132所抑制。(3)通过Real-Time PCR成功地获得了Jiv90基因在细胞和组织中的分布情况,在猪血管内皮细胞和猪肾细胞分布较高;在肺中的分布高于其他组织。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-10
文献综述  10-15
  第一章 分子伴侣研究进展  10-12
    1.1 分子伴侣的概念与种类  10
    1.2 分子伴侣的特征  10
    1.3 分子伴侣的功能  10-12
      1.3.1 分子伴侣对蛋白质正确折叠的影响  10-12
  第二章 分子伴侣Jiv90 与瘟病毒属成员相互作用研究进展  12-15
    2.1 分子伴侣Jiv90 与BVDV 的相互作用  12-14
    2.2 分子伴侣Jiv90 与CSFV 的相互作用  14-15
试验研究  15-35
  第三章 分子伴侣Jiv90 基因的克隆及原核表达  15-21
    3.1 材料  15-16
      3.1.1 材料和试剂  15
      3.1.2 主要仪器  15-16
    3.2 方法  16-17
      3.2.1 引物合成  16
      3.2.2 RT- CR 反应  16
      3.2.3 原核表达载体pET-32a-Jiv90 的构建及鉴定  16
      3.2.4 Jiv90 基因在大肠埃希菌中的表达  16-17
    3.3 结果  17-20
      3.3.1 Jiv90 基因的RT-PCR 扩增  17-18
      3.3.2 重组原核表达载体pET-32a-Jiv90 的酶切鉴定  18
      3.3.3 不同浓度IPTG 对Jiv90 蛋白的诱导表达分析  18-19
      3.3.4 不同时间对Jiv90 蛋白的诱导表达分析  19
      3.3.5 Jiv90 蛋白的可溶性分析  19-20
      3.3.6 融合蛋白pET-32a-Jiv90 蛋白的Wester blot 检测  20
    3.4 讨论  20
    3.5 小结  20-21
  第四章 猪Jiv90 蛋白降解特性的研究  21-29
    4.1 材料  21
      4.1.1 细胞株、菌株及载体  21
      4.1.2 主要工具酶、试剂及耗材  21
      4.1.3 主要仪器设备  21
    4.2 方法  21-23
      4.2.1 猪Jiv90 基因的克隆  21-22
      4.2.2 真核表达载体的构建与鉴定  22
      4.2.3 重组载体的细胞转染与稳定表达细胞株的建立  22
      4.2.4 表达产物的Real-time PCR 检测  22-23
      4.2.5 Western blot 对表达产物的鉴定  23
      4.2.6 Jiv90 蛋白降解特性的观察  23
    4.3 结果  23-27
      4.3.1 Jiv90 基因的RT-PCR 扩增与序列分析  23
      4.3.2 Jiv90 基因真核表达载体的构建与鉴定  23-24
      4.3.3 获得EC-pEGFP-N1-Jiv90 细胞株  24
      4.3.4 EC-pEGFP-N1- Jiv90 基因mRNA 的相对定量结果  24-25
      4.3.5 EC-pEGFP-N1- Jiv90 细胞株的Western blot 检测  25-26
      4.3.6 Jiv90 蛋白的降解特性观察  26-27
    4.4 讨论  27-28
    4.5 小结  28-29
  第五章 猪Jiv90 基因的细胞和组织分布情况  29-35
    5.1 材料  29-30
      5.1.1 细胞株和原代细胞  29
      5.1.2 主要工具酶、试剂及耗材  29-30
      5.1.3 主要仪器设备  30
    5.2 方法  30-31
      5.2.1 细胞的复苏与培养  30
      5.2.2 细胞及组织的处理  30
      5.2.3 RNA 提取(Trizol 法)  30
      5.2.4 RNA 产物的反转录  30-31
      5.2.5 Real-time PCR 检测Jiv90 基因细胞组织分布差异  31
    5.3 结果  31-33
      5.3.1 不同细胞中Jiv90 基因的分布差异情况  31-32
      5.3.2 Jiv90 基因在组织中分布差异  32-33
    5.4 讨论  33-34
    5.5 小结  34-35
结论  35-36
参考文献  36-40
致谢  40-42
作者简介  42

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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