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小鼠精原干细胞体外培养与冷冻技术研究

作　者: 凡志国
导　师: 胡建宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 小鼠精原干细胞支持细胞体外培养鉴定冷冻复苏率
分类号: Q813.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

精原干细胞的高效分离纯化与体外培养为精原干细胞的移植、多潜能性分化、体外诱导分化和转基因动物研究等多项研究奠定良好的基础,在医学、生物学和生物技术研究领域有着极其可贵的潜在价值。本研究以7d雄性昆系小鼠为试验材料,对小鼠精原干细胞进行分离、纯化、鉴定、培养和冷冻研究,以期获得纯度较高的分离纯化方法以及高效的培养方法和冻融技术,从而为男性不孕症的治疗和濒危物种的保护等提供一定的依据。本研究主要获得以下结果:1.小鼠精原干细胞大多以4细胞链、8细胞链和16细胞链的典型状态存在,从形态学上可以进行初步确定;碱性磷酸酶(AKP)存在小鼠精原干细胞的表面,用NBT/ BCIP试剂盒染色后,倒置显微镜下观察时可以看到棕褐色或蓝紫色的细胞,即为小鼠精原干细胞;对Beta-actin和Ngn3两个基因进行RT-PCR及凝胶电泳试验,由于Ngn3基因在支持细胞中无表达,凝胶电泳试验时没有条带,据此差异可以确定小鼠精原干细胞。本研究初步建立了小鼠精原干细胞形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色和Ngn3基因鉴定的综合鉴定方法。2.表皮促生长因子(EGF)、胰岛素样促生长因子-1(IGF-1)和碱性成纤维细胞促生长因子(bFGF)在单独使用、两两配伍和三因子共同配伍的条件下,采用预先处理和后处理的方法培养小鼠精原干细胞时,10% FSH (30 ng/ml)预先处理组单因子EGF(10ng/ml)能够明显促进小鼠精原干细胞增殖,其增殖率分别为41.60%;用10% FSH (30 ng/ml)预后处理双因子IGF-1(20 ng/ml)和bFGF(20 ng/ml)组以及用10% FSH(30 ng/ml)的预后处理三因子EGF(20 ng/ml)、IGF-1(20 ng/ml)和bFGF (10ng/ml)组均能促进小鼠精原干细胞的大量增殖,其增殖率分别63.00%和56.60%。3.低密度脂蛋白、海藻糖和卵磷脂三种冷冻保护剂在单独使用和两两配伍条件时,3mg/ml低密度脂蛋白单独使用、3mg/ml低密度脂蛋白和0.5mg/ml的卵磷脂配伍条件时小鼠精原干细胞的冷冻复苏率显著高于其它组(p <0.05),分别达到87.16%和90.23%,低密度脂蛋白和卵磷脂配伍有利于精原干细胞的冷冻保存。另外,-80℃超低温冰箱冷冻效果整体上要高于液氮冷冻。4.低密度脂蛋白、卵磷脂、海藻糖作为冷冻保护剂用于小鼠支持细胞的冷冻保存,分别于第1d、7d和15d检测复苏率。其中第7d时的效果最好,低密度脂蛋白、卵磷脂和海藻糖三组中的支持细胞复苏率分别为70.65%、72.86%和68.25%,显著高于其他组(p <0.05)。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-25
  第一章小鼠精原干细胞与支持细胞研究进展  12-25
    1.1 小鼠精原干细胞的研究进展  12-21
      1.1.1 小鼠精原干细胞的发生  12-13
      1.1.2 小鼠精原细胞的类型  13
      1.1.3 小鼠精原干细胞的生物学特性  13-14
      1.1.4 小鼠精原干细胞的生理学特性  14
      1.1.5 小鼠精原干细胞的形态学特征  14-15
      1.1.6 小鼠精原干细胞的分离与纯化  15-17
      1.1.7 小鼠精原干细胞的鉴定、培养、诱导与冷冻保存  17-21
    1.2 饲养层支持细胞的研究进展  21-23
      1.2.1 小鼠睾丸支持细胞的生物学特性  21
      1.2.2 小鼠饲养层支持细胞的功能  21-22
      1.2.3 小鼠睾丸支持细胞与精原干细胞的关系  22
      1.2.4 小鼠睾丸支持细胞的分离  22
      1.2.5 小鼠睾丸支持细胞的鉴定  22-23
      1.2.6 小鼠睾丸支持细胞的体外培养  23
    1.3 促生长因子对精原干细胞增殖作用的影响  23-24
      1.3.1 LIF 对精原干细胞体外增殖作用的影响  23
      1.3.2 GDNF 对小鼠精原干细胞体外增殖作用的影响  23-24
    1.4 小鼠精原干细胞体外培养研究的目的与意义  24-25
试验研究  25-58
  第二章小鼠精原干细胞的分离与纯化研究  25-31
    2.1 试验材料  25-26
      2.1.1 试验动物及处理  25
      2.1.2 试验试剂  25
      2.1.3 设备与器械  25-26
      2.1.4 试剂配制  26
    2.2 试验方法  26-28
      2.2.1 小鼠睾丸单细胞悬液的制备  26-27
      2.2.2 台盼蓝拒染法检测细胞活率  27
      2.2.3 四次反复差速贴壁法分离纯化精原干细胞  27-28
    2.3 试验结果与分析  28-29
      2.3.1 形态学观察  28
      2.3.2 台盼蓝染色  28
      2.3.3 碱性磷酸酶（AKP）染色  28-29
    2.4 讨论  29-30
      2.4.1 两步酶消化法获取睾丸单细胞悬液  29
      2.4.2 精原干细胞常用的分离纯化方法  29-30
    2.5 小结  30-31
  第三章小鼠精原干细胞的鉴定研究  31-36
    3.1 试验材料  31-32
      3.1.1 试验动物及处理  31
      3.1.2 试验试剂  31
      3.1.3 设备与器械  31
      3.1.4 试剂配制  31-32
    3.2 试验方法  32-34
      3.2.1 小鼠睾丸单细胞悬液的制备  32
      3.2.2 小鼠睾丸支持细胞的制备  32
      3.2.3 四次反复差速贴壁分离纯化小鼠精原干细胞  32
      3.2.4 小鼠精原干细胞（SSCs）的形态学鉴定  32
      3.2.5 碱性磷酸酶（AKP）染色  32
      3.2.6 Beta-actin 和 N9113 基因RNA 分离提取和RT-PCR  32-33
      3.2.7 引物设计  33-34
      3.2.8 PCR 扩增  34
    3.3 试验结果与分析  34-35
      3.3.1 形态学鉴定  34
      3.3.2 碱性磷酸酶（AKP）染色结果  34-35
    3.4 讨论  35
    3.5 小结  35-36
  第四章小鼠精原干细胞体外培养研究  36-46
    4.1 试验材料  36-38
      4.1.1 试验动物及处理  36
      4.1.2 试验试剂  36
      4.1.3 设备与器械  36-37
      4.1.4 试剂配制  37
      4.1.5 小鼠睾丸液的制备  37-38
    4.2 试验方法  38-39
      4.2.1 基础培养液  38
      4.2.2 培养液Ⅰ  38
      4.2.3 培养液Ⅱ  38
      4.2.4 试验处理方式  38-39
    4.3 统计分析  39
    4.4 试验结果与分析  39-43
      4.4.1 单因子培养对精原干细胞的增殖作用  39
      4.4.2 双因子配伍培养对精原干细胞的增殖作用  39-40
      4.4.3 三因子配伍培养对精原干细胞的增殖作用  40-42
      4.4.4 睾丸液对小鼠精原干细胞增殖的影响  42-43
    4.5 讨论  43-45
    4.6 小结  45-46
  第五章小鼠精原干细胞冷冻研究  46-58
    5.1 试验材料  46-47
      5.1.1 试验动物及处理  46
      5.1.2 试验试剂  46
      5.1.3 设备与器械  46
      5.1.4 试剂配制  46
      5.1.5 LDL 的制备  46-47
      5.1.6 LDL 溶液的配制  47
      5.1.7 卵磷脂溶液的配制  47
      5.1.8 海藻糖溶液的配制  47
    5.2 试验方法  47-48
      5.2.1 冷冻保护剂  47-48
      5.2.2 精原干细胞的冷冻方法  48
    5.3 统计分析  48-49
    5.4 试验结果与分析  49-55
      5.4.1 不同冷冻保护剂对小鼠精原干细胞冷冻复苏率的影响  49-51
      5.4.2 不同冷冻保护剂配伍对小鼠精原干细胞冷冻复苏率的影响  51-55
    5.5 讨论  55-57
    5.6 小结  57-58
结论与创新点  58-60
参考文献  60-69
致谢  69-70
作者简介  70

小鼠精原干细胞体外培养与冷冻技术研究

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