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黑熊成纤维细胞的冷冻保存及对黑熊—牛克隆胚体外发育的影响

作　者: 袁慧敏
导　师: 方南洙
学　校: 延边大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 黑熊成纤维细胞冷冻黑熊-牛克隆胚体外培养
分类号: S865.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本试验研究了黑熊耳部成纤维细胞的原代培养方法,并对黑熊成纤维细胞冷冻保存的冷冻保护剂和冷冻方法进行了筛选,探讨了处理后成纤维细胞对黑熊-牛克隆胚体外发育的成活影响,为建立黑熊-牛的克隆胚发育体系,促进黑熊-牛后代发育率,可为制作克隆动物、异构胚动物提供技术,为实验室的大局发展,学弟学妹的研究提供理论依据。所得结果如下：1.试验为了获得黑熊成纤维细胞系,将黑熊耳边缘皮肤组织块进行冷冻,并与未冷冻组织块比较。结果为：未冷冻组织块培养5d后开始游离细胞,细胞成活率为75%：冷冻组织块复苏后培养6d开始有细胞游离,细胞活率为68.7%。2.选用不同density的三种冷冻保护剂：二甲基亚砜(DMSO:5、7.5、10、12.5%)、乙二醇(EG：10、15、20、25%)、甘油(GC；C:5、10、15、20%))对黑熊成纤维细胞进行冷冻,结果为DMSO浓度为7.5%对黑熊耳部成纤维细胞冷冻效果最好。3.黑熊成纤维细胞分别在-70℃和-196℃下冻存一周、一个月、三个月,复苏后检验细胞活率发现-70℃一周活率较高,-196℃一周、一个月、三个月活率无差异。4.用MTT检测未冷冻和冷冻复苏后3-6、7-9、10-12代组细胞活力,结果为,未冷冻与冷冻复苏后3-6代组无差异、7-9代、10-12代组差异显著。5.使用正常培养的黑熊耳皮肤成纤维细胞的3-6、7-9、10-12代组分别进行供核,结果为7-9代黑熊成纤维细胞为最佳供体细胞代数,且异种重构胚发育率最好。6.分别将黑熊耳皮肤成纤维细胞的3-6、7-9、10-12代组用7.5%的DMSO进行冷冻保存,冷冻复苏后的3-6代、7-9代和10-12代组成纤维细胞为供体,其卵裂率、多细胞胚发育率、桑葚胚发育率无显著差异(P>0.5),但是7-9代组略好于其他两组。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
第一章前言  11-16
  1.1 哺乳动物异种克隆  11-12
  1.2 供核细胞保存的研究进展  12-14
  1.3 试验的意义  14-16
第二章材料与方法  16-22
  2.1 采用材料  16-18
  2.2 试验方法  18-22
第三章结果与分析  22-27
  3.1 冷冻保存对组织块贴壁效率的影响  22
  3.2 不同浓度DMSO对黑熊成纤维细胞冷冻效果的影响  22-23
  3.3 不同浓度甘油对黑熊成纤维细胞冷冻效果的影响  23
  3.4 不同浓度乙二醇对黑熊成纤维细胞冷冻效果的影响  23-24
  3.5 不同冷冻方法和时间对成纤维细胞冷冻效果的影响  24-25
  3.6 黑熊成纤维细胞活力分析  25
  3.7 不同代数的成纤维细胞供核对重构胚体外发育的影响  25-26
  3.8 冷冻处理不同代数成纤维细胞做供体对重构胚体外发育的影响  26-27
第四章讨论  27-30
  4.1 冷冻黑熊耳边缘组织培养  27
  4.2 不同浓度的渗透性冷冻保护剂对黑熊耳边缘成纤维细胞存活率的研究  27-28
  4.3 不同冷冻程序及时间对细胞存活率的影响  28
  4.4 不同代数的黑熊成纤维细胞供核对重构胚胚胎体外发育的影响  28-29
  4.5 冷冻处理不同代数的黑熊成纤维细胞供核对重构胚胚胎体外发育的影响  29-30
第五章结论  30-31
参考文献  31-36
致谢  36

黑熊成纤维细胞的冷冻保存及对黑熊—牛克隆胚体外发育的影响

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