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小鹅瘟病毒VP_3基因疫苗在免疫雏鹅体内动态分布及表达规律的研究

作　者: 黎敏
导　师: 程安春；汪铭书
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: FQ-PCR pcDNA-GPV-VP3 GPV弱毒疫苗 雏鹅 动态分布表达
分类号: S858.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 67次
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内容摘要


本文围绕小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因检测方法、GPV VP3基因疫苗及其GPV弱毒疫苗免疫雏鹅以后在机体分布及表达等开展了下列研究：①检测小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的建立，②将GPV-VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）分别以每只200μg、100μg、50μg肌肉注射，6μg、-3μg、1μg基因枪轰击的方法免疫30日龄四川白鹅，然后用FQ-PCR和免疫组织化学的方法检测在动物体内（心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胰腺、血液、脑及注射部位皮肤）分布及表达规律，③将GPV弱毒疫苗以每只200μL肌肉注射免疫免疫30日龄四川白鹅做对照，比较其和GPV-VP3基因疫苗进入机体后分布及表达的差异。获得如下结果：1．建立的FQ-PCR特异性强、灵敏度高、重复性好，核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值相关系数达到0.999，具有很好的直线相关性。2．pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内的分布规律：各剂量免疫雏鹅1h即可在各组织中被检测到，其中免疫部位含量最高，其次是肝、肾、淋巴器官（脾、法氏囊、胸腺、哈氏腺）；到217d时，各组雏鹅各个组织器官内仍检测到pcDNA-GPV-VP3的存在，但多数组织器官中的含量比1h时约低了少了103-104，其中免疫部位减少了约104-105；血液中pcDNA-GPV-VP3的含量较少，1h比其他组织低101-102；随后含量开始下降，随着时间的推移，pcDNA-GPV-VP3在各组织器官中含量的下降速度有变慢的趋势，3d-21d约下降了100.1-100.5，到63d-217d含量仅下降了100.5-101；脑1h-12h含量呈上升趋势，12h时达到最大值，随后下降。3．pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内的表达规律：pcDNA-GPV-VP3的表达产物1d时能在免疫部位中的细胞质中检测到，基因枪组1d阳性颗粒最多，肌肉组时达到最多，63d肌肉组免疫部位中仍能检测到阳性颗粒，肠腺和肠绒毛上的杯状细胞细胞质／心肌细胞核也能检测到较多阳性；肝细胞间质中有零星表达，肺、肾、脾、胰腺、脑、法氏囊、胸腺中未见表达。4．不同途径免疫pcDNA-GPV-VP3后在雏鹅体内的的分布和表达差异：不同途径免疫后，pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内广泛分布，并在心、肝、肠道和免疫部位表达，在免疫早期，基因枪组中各组织中pcDNA-GPV-VP3的含量普遍大于肌肉注射组，心、肝中棕黄色阳性颗粒出现比肌肉注射组早，但到217d时两种免疫方式都未能检测到表达产物。5．不同剂量与分布和表达的关系：不同剂量pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为6μg组＞3μg组＞1μg组，200μg组＞100μg组＞50μg组，说明基因疫苗的剂量和分布、表达呈现一定的正相关性；6．GPV弱毒疫苗在雏鹅体侵染和排泄：GPV弱毒疫苗免疫雏鹅后，病毒含量1h-3d呈现下降后回升的趋势，7d时达到最大值，35d逐渐下降，1d-3d时能在免疫部位、心、肠道和肝中检测到病毒抗原，第7d量达到最大；与基因疫苗组相比，GPV弱毒疫苗在各组织内检测到的含量大，差异显著（0.01≤P≤0.05），表达抗原数量多，但数量下降的很快，63d时，各组织内未能检测到抗原物质。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
前言  9-13
1.材料  13-16
  1.1 质粒与菌株  13
  1.2 实验动物  13
  1.3 疫苗  13
  1.4 参考毒(菌)株  13
  1.5 主要仪器设备  13-14
  1.6 主要试剂及溶液配制  14-16
2.方法  16-23
  2.1 TaqMan探针荧光定量PCR检测pcDNA-GPV-VP3方法的建立  16-19
  2.2 兔抗GPV高免血清的制备及其IgG提取  19
  2.3 动物的免疫接种及组织样品的采集  19-20
  2.4 定量PCR方法检测pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内各组织中的分布规律  20-21
  2.5 间接免疫组织化学法检测pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内各组织中表达规律  21-23
3 结果  23-41
  3.1 TaqMan探针荧光定量PCR检测pcDNA-GPV-VP3方法的建立  23-28
  3.2 兔抗GPV抗体的制备和纯化  28
  3.3 pcDNA-GPV-VP3免疫后雏鹅的临床表现  28
  3.4 pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内各组织中的分布规律  28-33
  3.5 pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内各组织中表达规律  33-41
4 讨论  41-48
  4.1 FQ-PCR检测基因疫苗在体内动态分布的优势  41-42
  4.2 pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内的分布表达规律及其意义  42-44
  4.3 不同免疫途径与pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内分布表达的关系  44-46
  4.4 不同免疫剂量对基因疫苗分布部位和含量的影响  46
  4.5 雏鹅免疫pcDNA-GPV-VP3基因疫苗和GPV弱毒疫苗后分布和表达的比较  46-48
5.结论  48-49
参考文献  49-56
致谢  56-57
附录  57-66
攻读学位期间发表的学术论文目录  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鹅
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