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洛克沙胂诱导斑马鱼组织中HSP70表达的研究

作　者: 朱爱华
导　师: 张雨梅
学　校: 扬州大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 洛克沙胂 HSP70 斑马鱼免疫组织化学 RT-PCR FQ- PCR
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

洛克沙胂(roxarsone, ROX)是一种在畜禽养殖中广泛使用的饲料添加剂,具有抗菌、抗球虫、提高饲料转化率、促生长等作用。洛克沙胂进入动物体后,大部分以原形随粪便排出体外。在我国,畜禽粪便一般只经简单处理或不处理,作为有机肥用于农业肥料。目前集约化养殖排污模式中约50%～70%的猪场直接将粪尿排至鱼塘、河流。洛克沙胂随有机肥或养殖场排污系统进入环境后,将导致对土壤和水环境造成污染。应激蛋白又称为热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs),是一切生物细胞(包括原核细胞及真核细胞)在受热、病原体、理化因素等应激原刺激后,发生应激反应时所产生的一类在生物进化中高度保守蛋白。应激蛋白具有多种生物学功能,在应激耐受和应激保护中发挥重要作用。根据HSPs分子量的不同,通常分为HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子量HSP家族。其中,HSP70家族是最保守、最重要的一族,在大多数生物中含量最多,在细胞应激后生成最明显,家族成员也最多,并且是对污染物的应激反应后生成最为显著的一类应激蛋白。大量研究表明,许多污染物胁迫下,都能引起水生生物体内HSP70显著诱导,显示其具有作为水环境生态安全早期预警指标的巨大潜力。本文主要以斑马鱼为实验动物,通过洛克沙胂对斑马鱼的急性毒性试验,作为试验剂量设计的依据。通过100mg/L洛克沙胂暴露的斑马鱼组织中HSP70的SABC法免疫组织化学、RT-PCR和荧光定量PCR分析,研究HSP70、HSC70及HSF1的诱导表达机制以及HSP70作为生物标志物的可行性。洛克沙胂暴露下斑马鱼的急性毒性试验表明,斑马鱼96h的LC50为249.80 mg/L,95%可信范围为248.65~250.95 mg/L。免疫组织化学的结果为:100mg/L洛克沙胂暴露下,HSP70蛋白在斑马鱼的肝脏、鳃、性腺三种组织中有特异性表达。斑马鱼鳃小片的基底膜、鳃弓和鳃丝上皮细胞及红细胞的胞质中阳性染色明显;性腺组织基质细胞的胞质中有HSP70的强阳性表达;在肝脏中阳性信号相对较弱,主要分布在静脉血管四周和红细胞胞质中。通过RT-PCR方法,扩增出斑马鱼组织hsp70、hsc70和hsf1mRNA特异性条带,片段大小分别为457bp、412bp和605bp。荧光定量PCR进一步分析洛克沙胂不同暴露时间这三种基因mRNA表达丰度,试验结果显示洛克沙胂暴露下,斑马鱼不同组织中hsp70、hsc70和hsf1mRNA有显著的诱导表达,表现出一定程度的波动性和规律性。斑马鱼性腺、鳃和肝脏中hsp70、hsc70和hsf1三种基因在洛克沙胂诱导后12h,均有最高表达。相对于空白组织的表达量,12h时性腺中这三种基因的表达倍数,性腺中达26.590、13.810、17.716倍;鳃中分别为52.721、34.925、59.727倍;肝脏中分别为4.53、3.796、3.275倍。从表达峰值来看,这三种基因在鳃中表达最高,性腺中次之,肝脏中最少。在诱导6h时,鳃组织中这三种基因的表达即分别达4.948、18.498、2.501倍;肝脏中表达量分别为1.736、2.232、1.754倍;而性腺中分别为1.045、0.627、1.045倍。从时间上来看,这三种基因的诱导表达启动鳃最早,肝脏次之,性腺相对较晚。综上所述,HSP70及相关蛋白显示出作为生物标志物在有机胂环境污染中应用的巨大潜力和前景。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
符号说明  9-10
第一部分文献综述  10-25
第二部分试验研究  25-54
  引言  25-27
  第一章洛克沙胂对斑马鱼的急性毒性试验  27-29
    1 材料与方法  27-28
    2 结果与讨论  28-29
  第二章洛克沙胂暴露对斑马鱼组织中HSP70 表达的免疫组织化学研究  29-34
    1 材料与方法  29-30
    2 结果  30
    3 讨论  30-34
  第三章洛克沙胂诱导斑马鱼组织中hsp70、hsc70、hsf1 基因表达的RT-PCR分析  34-42
    1 材料与方法  34-36
    2 结果与讨论  36-42
  第四章实时定量 PCR 检测洛克沙胂诱导斑马鱼hsp70、hsc70 和hsf1 基因mRNA 的表达  42-54
    1 材料与方法  42-45
    2 结果  45-52
    3 讨论  52-54
全文结论  54-55
参考文献  55-61
致谢  61

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