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链霉菌LA5高产菌株诱变育种研究

作　者: 李戈
导　师: 曾会才
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 分子植物病理学
关键词: 链霉菌LA5菌株辣椒疫霉菌诱变育种毒性实验
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 354次
引　用: 2次
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内容摘要

放线菌LA5菌株是从海南儋州长坡辣椒植株上分离获得的一株生防菌,经16SrDNA序列分析,与灰色链霉菌的同源性最高,序列一致性达99.59%,属链霉菌属。前期研究表明:链霉菌LA5菌株产生的抗生素对辣椒疫霉菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌和稻瘟菌等多种植物病原真菌具有强烈的抑制作用,其发酵液在盆栽试验中对辣椒疫病具有90%的防治效果,在田间具有80%的防治效果;LA5抗生素包括水溶性和脂溶性两部分,水溶性成份在常温下贮藏6个月、54℃下放置15天、阳光照射8小时和中性、弱碱条件下抑菌活性均不降低,符合农药稳定性要求,具有开发成农用抗生素的前景。其产抗生素的优化发酵培养条件是初始pH6.8、培养温度28℃、接种量5%、摇瓶装液量100ml/300ml、转速200r/min、发酵时间120h。但在优化条件下,野生型菌株的产素水平仍然较低,不能满足工业化开发的要求。本项研究以LA5为出发菌株,以辣椒疫霉为测试病原菌,采用复合诱变方法进行了LA5抗生素高产菌株的诱变筛选,其主要研究结果如下:通过对“紫外线+亚硝基胍”和“亚硝基胍+紫外线”两种处理方法的诱变效应进行研究,结果表明,在“紫外线+亚硝基胍”处理中,以“紫外线照射80sec+亚硝基胍处理80min”诱变方法的正突变率最高,为30%;在“亚硝基胍+紫外线”处理中,以“亚硝基胍处理80min+紫外线照射40sec”及“亚硝基胍处理60min+紫外线照射120sec”两种诱变方法的正突变率最高,都为26%。因此,以这三种诱变方法作为LA5菌株进一步诱变的方法。对第一次诱变获得的正突变菌株进行摇瓶发酵复筛,筛选出5株抑菌活性极显著高于LA5出发菌株的突变菌株D-16、F-20、g-14、3h-41、G-14,其抑菌效果分别比链霉菌LA5菌株提高了7.02%、10.52%、12.28%、16.67%、17.54%。以D-16、F-20、g-14、3h-41、G-14为出发菌株,,采用“紫外线照射80sec+亚硝基胍处理80min”复合诱变方法进行第二次诱变,经初筛和复筛,获得了5株抑菌活性分别比抑菌效果最好的出发菌株3h-14提高3.51%、4.68%、5.07%、6.24%、9.35%的突变菌株G14-33、F20-43、g14-7、D16-14、3h41-13,其中突变菌株D16-14、3h41-13的抑菌效果极显著高于出发菌株3h-14。以G14-33、F20-43、g14-7、D16-14、3h41-13五个突变菌株为出发菌株,采用“亚硝基胍处理80min+紫外线照射40sec”复合诱变方法进行第三次诱变,经初筛和复筛获得了5株突变菌株F20-43-14、g14-7-28、3h41-13-15、D16-14-36、3h41-13-32,其抑菌活性分别比抑菌活性最高的出发菌株F20-43分别提高了1.08%、1.75%、2.34%、4.68%、7.6%。以F20-43-14、g14-7-28、3h41-13-15、D16-14-36、3h41-13-32五个突变菌株为出发菌株,采用“亚硝基弧60min+紫外线诱变120sec”复合诱变方法进行第四次诱变,经初筛和复筛,获得了1株抑菌活性极显著高于抑菌活性最好的出发菌株D16-14-36的突变菌株3h32-32,其抑菌活性比D16-14-36提高了10.18%,比原始出发菌株LA5提高了34.50%。此外,本研究还研究了LA5菌株的一些生物学特性。结果是:不同浓度的多菌灵对LA5菌株的产孢量、菌丝生长量和产抗生素能力没有影响。LA5菌株发酵液常温下保存3个月,LA5菌株在其发酵液中的产孢量没有明显变化,为6×10~7-6.4×10~7个。LA5发酵液灌胃小白鼠一周后,行动正常,取食正常;饲喂白鼠3个月后,行动、取食正常;新出生的小白鼠,活动正常,外型无变化,毛色光泽。毒性试验结果表明,LA5发酵液对小白鼠无毒性。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
1 文献综述  11-21
  1.1 诱变在产抗生素微生物育种中的应用  12-14
    1.1.1 提高抗生素产量  12-13
    1.1.2 减少杂质，改进抗生素质量  13
    1.1.3 改变产物组分，合成新的抗生素产品  13
    1.1.4 改进菌株发酵工艺特性  13
    1.1.5 用于研究抗生素的生物合成途径  13-14
  1.2 诱变育种方法  14-20
    1.2.1 紫外线（UV）诱变育种  14-15
    1.2.2 激光诱变育种  15-16
    1.2.3 离子束注入诱变育种  16-17
    1.2.4 空间诱变育种  17-18
    1.2.5 微波辐射诱变育种  18-19
    1.2.6 甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍，NTG）诱变育种  19-20
  1.3 微生物诱变育种展望  20-21
2 引言  21-22
3 材料和方法  22-28
  3.1 材料  22-23
    3.1.1 菌种  22
    3.1.2 主要仪器设备  22
    3.1.3 培养基  22-23
  3.2 方法  23-27
    3.2.1 菌种复壮  23
    3.2.2 种液培养  23
    3.2.3 摇瓶培养条件  23
    3.2.4 不同浓度的多菌灵对链霉菌LA5 生物学特性的影响  23-24
    3.2.5 LA5 发酵液中 LA5 产孢量随时间的变化  24-25
    3.2.6 LA5 菌株的诱变育种方法  25-26
    3.2.7 生物活性检测  26
    3.2.8 抗生素高产菌株的摇瓶发酵复筛  26-27
    3.2.9 各种诱变处理效应的评价  27
  3.3 第二次诱变育种方法  27-28
    3.3.1 第三诱变育种方法  27
    3.3.2 第四诱变育种方法  27
    3.3.3 LA5 菌株发酵液的毒性实验  27-28
4 结果与分析  28-55
  4.1 不同浓度的多菌灵对链霉菌LA5 生物学特性的影响  28-29
    4.1.1 不同浓度的多菌灵对链霉菌LA5 产孢量的影响  28
    4.1.2 不同浓度的多菌灵对链霉菌LA5 菌丝产量的影响  28
    4.1.3 不同浓度的多菌灵对链霉菌LA5 产抗生素能力的影响  28-29
  4.2 链霉菌LA5 产孢量在链霉菌LA5 发酵液中随时间的动态变化  29-30
  4.3 链霉菌LA5 菌株的诱变结果  30-37
    4.3.1 冰浴时间对链霉菌 LA5 菌株的紫外线诱变杀菌率的影响  30-32
    4.3.2 链霉菌LA5 菌株的亚硝基胍+紫外线复合诱变  32-35
    4.3.3 链霉菌 LA5 菌株的紫外线+亚硝基胍复合诱变  35-37
  4.4 各种诱变方法诱变效应的评价  37-41
    4.4.1 紫外线照射后不同冰浴时间处理的诱变效应  37-38
    4.4.2 亚硝基胍+紫外线复合诱变的诱变效应  38-40
    4.4.3 紫外线+亚硝基胍复合诱变的诱变效应  40-41
  4.5 正突变菌株的摇瓶发酵复筛  41-43
    4.5.1 不同诱变剂方法初筛到的正突变菌株的摇瓶发酵筛选结果  41-43
  4.6 第二次诱变结果（紫外线照射80SEC+亚硝基胍处理80MIN）  43-47
    4.6.1 第二次诱变初筛结果  43-46
    4.6.2 第二次诱变初筛的正突变菌株的复筛结果（毒介法）  46-47
  4.7 第三次诱变结果（亚硝基胍处理80MIN+紫外线照射40SEC）  47-51
    4.7.1 第三次诱变初筛结果  47-49
    4.7.2 第三次诱变筛选的正突变菌株的复筛结果（毒介法）  49-51
  4.8 第四次诱变结果（亚硝基弧60MIN+紫外线诱变120SEC）  51-54
    4.8.1 第四次诱变初筛结果  51-53
    4.8.2 第四次诱变筛选的正突变菌株的复筛结果（毒介法）  53-54
  4.9 链霉菌LA5 发酵液小白鼠毒性的实验结果  54-55
    4.9.1 行动、取食、体重情况  54-55
    4.9.2 母鼠（LA5 饲喂）妊娠  55
5 结论与讨论  55-58
  5.1 结论  55
  5.2 讨论  55-58
参考文献  58-62
致谢  62

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