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以麦糟为原料生物法制备嗜热β-葡聚糖酶技术的研究

作　者: 韩晶
导　师: 李开雄；李宝坤
学　校: 石河子大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 枯草芽孢杆菌嗜热β-葡聚糖酶诱变育种发酵工艺酶学性质
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在啤酒和饲料生产中产生的负面影响。因此,在啤酒和饲料工业中β-葡聚糖酶发挥着重要作用。与国外相比,我国对β-葡聚糖酶的研究起步较晚,且研制的β-葡聚糖酶的热稳定性普遍较差,不能满足现代啤酒糖化工艺和颗粒饲料造粒的温度要求,寻求嗜热β-葡聚糖酶高产菌株一直是人们关注的焦点和研究的方向。因此,提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有非常重要的意义。本论文从菌种分离筛选入手,通过物理、化学诱变选育获得产嗜热β-葡聚糖酶酶活较高的突变株AS35并研究了其产酶特性,通过单因素试验和响应曲面法优化了摇瓶发酵产酶条件,初步分离纯化了β-葡聚糖酶,揭示了粗酶液的部分酶学性质,最后探讨了添加保护剂对粗酶液热稳定性和储藏稳定性的影响,为工业化生产和应用提供理论依据和参考。主要结论如下:1、从吐鲁番采集的高温土样中分离筛选出一株产嗜热β-葡聚糖酶活力较高的野生菌株X-5,37℃发酵培养60 h,发酵液酶活性达8.64 U/ml。经形态学和生理生化鉴定,初步确定野生菌株X-5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。2、对野生菌株X-5采用紫外辐射和硫酸二已酯复合诱变,获得产酶水平明显提高的突变株AS35,同等条件下发酵酶活性达15.83 U/ml,是出发菌株X-5的1.83倍,传代试验证明该突变株产酶性能比较稳定。3、通过单因素试验和响应曲面实验,对其摇瓶发酵产嗜热β-葡聚糖酶的培养基进行了优化,最佳培养基组成为（g/L）:麦糟粉47.476、玉米粉15.0、蛋白胨11.539、（NH₄）₂SO₄ 3.0、K₂HPO₄ 2.310、CaCl₂ 1.0、NaCl 5.0、MgSO₄·7H₂O 0.4、FeSO₄·7H₂O 0.01、Tween-80 0.096 ml/100ml。验证实验表明β-葡聚糖酶活性达30.66 U/ml,与模型预测的结果31.33 U/ml接近,相对误差为2.13%。在此基础上,通过单因素优化实验研究了发酵环境因子对菌株AS35产酶能力的影响。优化结果为:种龄18h、接种量12%、摇瓶装液量50 m1/250 m1、摇床转速210 r/min、培养温度36℃、初始pH 7.0、最佳发酵时间60h。在上述优化工艺条件下,发酵液中β-葡聚糖酶活性最高达32.12 U/ml,比工艺优化前（15.83 U/ml）提高了近1倍。4、对该酶的性质研究表明:该酶在55℃-65℃之间酶活力较高,最适反应温度为60℃;最适反应pH为5.5,在pH4.0-7.0范围内有较高的稳定性,在4℃保存24h后,残余酶活均在85%以上;在lmmol/L的浓度下,Fe²⁺、Co²⁺、Ca²⁺,尤其是Co²⁺对酶活性有明显的激活作用;K⁺、Na⁺、Mn²⁺、Mg²⁺对酶活性的影响不大; Cu²⁺、Zn²⁺对酶活性有轻微的抑制作用; Pb²⁺、Fe³⁺、A1³⁺对酶活性有明显的抑制作用,酶活性几乎完全被抑制。5、黄原胶、甘油和CaC1₂等保护剂,能够在一定程度上提高酶液的热稳定性。经正交实验和验证实验,最终选择了组成为黄原胶3 g/L,CaC1₂ 2.0 mmo1/L和甘油30 g/L的复合保护剂。复合保护剂提高了该酶的热稳定性,使酶的主要活力损失范围由50℃-70℃提高到了55℃-70℃;复合保护剂和1 g/L苯甲酸钠配合使用能明显提高酶液的储藏稳定性,在室温下放置1.5个月,相对残留酶活高达85.23%,比对照组提高15.0%左右。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
缩略词表  11-12
前言  12-13
第一章文献综述  13-27
  1.1 啤酒糟简介  13-14
    1.1.1 啤酒糟的定义及营养成分  13
    1.1.2 生物技术在啤酒糟资源开发中的应用  13-14
  1.2 β-葡聚糖概述  14-18
    1.2.1 β-葡聚糖的结构和性质  14-16
    1.2.2 β-葡聚糖的负面影响  16
    1.2.3 麦芽中水解大麦β-葡聚糖的相关酶系  16-18
  1.3 嗜热酶的研究进展  18-19
    1.3.1 嗜热酶的定义和作用  18
    1.3.2 嗜热酶的生物化学和分子生物学特性  18-19
    1.3.3 嗜热酶基因的克隆与表达  19
  1.4 β-葡聚糖酶的研究进展  19-26
    1.4.1 β-葡聚糖酶的分布  19-20
    1.4.2 β-葡聚糖酶的分类及作用方式  20-21
    1.4.3 β-葡聚糖酶的酶学性质  21-22
    1.4.4 β-葡聚糖酶的结构与功能研究  22-24
    1.4.5 β-葡聚糖酶酶活力测定方法  24
    1.4.6 β-葡聚糖酶的应用  24-26
  1.5 本课题的选题背景及研究内容  26-27
第二章嗜热β-葡聚糖酶产生菌的分离、筛选及其鉴定  27-35
  2.1 引言  27
  2.2 材料与方法  27-31
    2.2.1 主要药品  27
    2.2.2 主要试剂  27-28
    2.2.3 主要仪器与设备  28
    2.2.4 培养基及发酵条件  28-29
    2.2.5 实验方法  29-31
  2.3 结果与分析  31-33
    2.3.1 菌种分离与筛选  31-32
    2.3.2 菌种的初步鉴定  32-33
  2.4 结论  33-35
第三章高产嗜热β-葡聚糖酶菌种的诱变选育研究  35-43
  3.1 引言  35
  3.2 材料与方法  35-38
    3.2.1 出发菌株及其来源  35
    3.2.2 培养基及培养条件  35-36
    3.2.3 主要试剂  36
    3.2.4 主要仪器与设备  36
    3.2.5 实验方法  36-38
  3.3 结果与分析  38-42
    3.3.1 出发菌株生长曲线的绘制  38
    3.3.2 紫外诱变效应曲线及诱变剂量的选择  38-39
    3.3.3 DES 诱变效应曲线及诱变剂量的选择  39
    3.3.4 菌种复合诱变选育结果  39-41
    3.3.5 突变菌株AS35 遗传稳定性的考察  41
    3.3.6 高产嗜热β-葡聚糖酶突变菌株AS35 选育谱系  41-42
  3.4 结论  42-43
第四章 Bacillus subtilis AS35 产酶的发酵动力学研究  43-64
  4.1 引言  43
  4.2 材料与方法  43-46
    4.2.1 菌株  43
    4.2.2 培养基  43-44
    4.2.3 主要原料及试剂  44
    4.2.4 主要仪器与设备  44
    4.2.5 分析测定与麦糟粉制备方法  44
    4.2.6 试验设计  44-45
    4.2.7 数据与统计分析  45-46
  4.3 结果与分析  46-63
    4.3.1 培养基成分单因素试验结果与分析  46-52
    4.3.2 培养基成分优化四因素二次通用旋转中心组合设计结果与分析  52-59
    4.3.3 发酵环境因子单因素试验优化设计  59-63
  4.4 结论  63-64
    4.4.1 培养基成分单因素试验结论  63
    4.4.2 培养基成分优化四因素二次通用旋转中心组合设计实验结论  63
    4.4.3 发酵环境因子单因素优化设计实验结论  63-64
第五章粗酶液的制备及其酶学性质的研究  64-78
  5.1 引言  64
  5.2 材料与方法  64-67
    5.2.1 初酶液  64
    5.2.2 主要药品和试剂  64
    5.2.3 主要仪器与设备  64
    5.2.4 实验方法  64-67
  5.3 结果与分析  67-76
    5.3.1 粗酶液的制备  67-68
    5.3.2 pH 对粗酶液的影响  68-69
    5.3.3 温度对粗酶液的影响  69-71
    5.3.4 金属离子对酶活的影响  71
    5.3.5 添加保护剂对酶稳定性的影响  71-76
  5.4 结论  76-78
第六章结论与展望  78-80
  6.1 结论  78-79
  6.2 创新点  79
  6.3 展望  79-80
参考文献  80-87
附录  87-89
致谢  89-90
作者简介  90-91
导师评阅表  91

以麦糟为原料生物法制备嗜热β-葡聚糖酶技术的研究

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