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小鼠EMSP1基因敲除载体构建及ES细胞饲养层制作研究

作　者: 姚淑珍
导　师: 吕文发
学　校: 吉林农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 小鼠 EMSP1 基因敲除胚胎成纤维细胞胚胎干细胞饲养层
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

胚胎干细胞体外成功培养与基因打靶技术相结合使人类可以改变动物的遗传性状，获得人为改造的动物模型。建立小鼠模型是基因打靶的主要热点，首先在胚胎干细胞水平进行操作，获得表达目的基因的单克隆细胞，尔后将细胞进行囊胚腔注射，得到表达目的基因的嵌合体小鼠，再进一步培育出整合于生殖系的小鼠品系，这一套技术路线在制备基因剔除小鼠时已经被成功地运用。该技术的优点之一是可以对每个单克隆细胞进行分析，并由此培育出单克隆细胞发育而来的小鼠。同时，本实验过程中采用的基因敲除及胚胎干细胞培养技术为将来开展动物基因敲除奠定技术基础。本研究对EMSP1基因组序列进行分析并结合GenBank上提供的小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因序列（10134bp），采用Oligo6.0软件设计两对引物，以129小鼠尾采血提取得到的DNA为模板，分别扩增长为5.0kb和1.7kb的片段作为同源长短臂。然后将回收的同源长短臂克隆入pGEM^?-T载体上，经过PCR及酶切鉴定，以及DNA核苷酸序列分析，证实长短臂的同源率分别为97.43％和98.10％。将同源长臂经SalⅠ和XbaⅠ双酶切，同源短臂经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后分别插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因Neo两侧多克隆位点，成功构建了小鼠EMSP1基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm。在胚胎干细胞饲养层制作中选用11.5～14.5天ICR小鼠胚胎为材料，采用胶原酶消化的方法，分离成纤维细胞，培养几代去除杂细胞后用于小鼠胚胎干细胞饲养层制作实验。将培养状态良好的小鼠胚胎成纤维细胞计数后，利用不同浓度的丝裂霉素C处理适当时间且计算好细胞数后，铺成单细胞层的胚胎干细胞饲养层，体外培养观察饲养层细胞的生长状态。经实验分析比较认为：以12.5天ICR小鼠胚胎为材料的成纤维细胞分离培养的效果良好，原代培养的第二代到第五代可以用于胚胎干细胞饲养层的制作。当丝裂霉素C处于10mg／L的浓度时，处理细胞浓度为3×10⁵个／ml的小鼠胚胎成纤维细胞2小时，获得的饲养层细胞状态较好，符合胚胎干细胞的培养要求。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
前言  7-9
第一部分:文献综述  9-26
  1 基因敲除小鼠研究和应用  9-23
  2 EMSP1蛋白酶研究进展  23-26
第二部分:研究内容  26-56
  实验一小鼠EMSP1基因敲除载体构建  26-45
    1 材料与方法  26-37
    2 结果  37-41
    3 讨论  41-44
    4 小结  44-45
  实验二小鼠胚胎干细胞饲养层制作研究  45-56
    1 材料与方法  45-51
    2 结果  51-53
    3 讨论  53-55
    4 小结  55-56
结论  56-57
参考文献  57-61
英文缩写词表  61-62
致谢  62-63
个人简介  63-64
英文简历  64

小鼠EMSP1基因敲除载体构建及ES细胞饲养层制作研究

内容摘要

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