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急性铅暴露对幼年大鼠脑海马中PKC-γ，NOS，NO的影响

作　者: 申小爱
导　师: 孙黎光
学　校: 中国医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 铅暴露小鼠蛋白激酶C-γ 长时程增强一氧化氮合酶一氧化氮
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的重金属铅是一种普遍存在的环境神经毒物，具有很强的神经亲和性，可在神经组织中蓄积，引起神经系统功能（主要是学习记忆功能）的长期损害。特别是对儿童学习，记忆，心理行为的影响受到人们的普遍关注。由于儿童血脑屏障发育不完整，当血铅水平达到100μg/L时便能导致学习记忆及行为异常。因此探讨铅致神经中毒机制非常重要。目前铅神经毒作用机制研究中的一个重要内容就是探讨铅对中枢神经细胞信号传导过程中的两个重要因素钙和蛋白激酶功能的影响。后者如蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein Kinase，ERK）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）等。蛋白激酶C是一种钙活化的磷脂依赖性的丝氨酸/苏氨酸激酶。在调控细胞的许多生理过程，特别是在细胞内信息传递途径中，PKC起着一个关键的作用。目前，在铅的神经毒性研究过程中，铅对PKC的作用引起人们极大关注。铅比钙对PKC有更高的亲和力。现已知，pb²⁺可以取代Ca²⁺激活蛋白激酶在学习记忆中的正常功能和PKCγ同工酶的分布。从而干扰LTP（长时程增强）的形成和维持。但做为脑组织中所独有的蛋白激酶C的一个亚型，PKC-γ在小鼠脑组织中的表达变化情况尚未清楚，有进一步进行研究的可行性。本研究通过对急性染铅小鼠脑海马中PKC-γ的异常表达探讨铅的神经毒理作用机制。一氧化氮（nitric oxide，NO）作为中枢神经系统细胞间的信息分子，在脑海马内主要影响学习记忆功能。一氧化氮合酶（NOS synthase，NOS）是催化合成内源性NO的唯一酶类，在很大程度上决定着NO的生物学效应。NOS是铅毒作用的靶分子之一，本研究通过NOS活性和NO含量测定，进一步探讨急性染铅对它们的影响机制。本研究从细胞信号转导角度较全面地探讨铅对学习记忆影响的生化机制。证明急性铅中毒可干扰PKC-γ的表达，扰乱NOS活性和降低NO含量，使小鼠空间学习记忆及被动回避反应学习记忆能力下降。为揭示铅中毒机制提出了新观点。方法1．大鼠急性铅暴露脑片的制作出生30d健康大鼠，颈部脱臼法处死，迅速取出海马，放入预冷的人工脑脊液(ACSF，mmol·L^-1NaCl 124，KCl 4.4，CaCl₂ 2.5，MgSO₄ 1.3，NaH₂PO₄ 1，NaHCO₃ 26，葡萄糖10)中。将海马横切为350μm脑片放到6孔培养板中，分为对照组和染铅组。用预先通以95％O₂+5％CO₂的混合气体的ACSF灌流，流速1 mL·min^-1，温度32.5～33.5℃。稳定2 h后，染铅组改用含20μmol·L^-1醋酸铅的ACSF灌流。醋酸铅加入培养板时间计时为0 min．。分别于0，3，7．5，15，30，60，120 min．收集脑片，即为急性染铅大鼠海马脑片样品，对照组始终以ACSF灌流并与急性染铅组同一时间收集脑片。将培养的大鼠海马脑片放到0.5 g·L^-1 MTT中室温观察15 min．，如颜色由白变黑则证明存活。在所有脑片收集完成后剩余的脑片仍然存活则保留所收集的样品，否则弃之。在10倍于其体积的裂解缓冲液中迅速搅成匀浆。将样品以12000g离心1hr。吸出上清液，弃去沉淀，加入样品缓冲液，将制备好的样品置于-70℃冰箱备用。2．测定指标及方法2．1利用PKC-γ抗体，Western blot方法测定急性染铅小鼠海马中PKC-γ异常表达（标本处理，提取蛋白质，蛋白定量，电泳，电转移，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色）。2．2利用NO和NOS试剂盒测定NO含量和NOS活性（原理是采用检测NO的中间代谢产物亚硝酸盐来反映NO。离心后取上清液再加入检测试剂，酶标仪测吸光度值，通过标准曲线回归方程计算亚硝酸盐的含量，换算出NO含量。采用放射强度测定法测定NOS活性）。3．统计分析处理数据以（?）±s表示，用SPSS 11.5软件统计包进行独立样本t检验。结果1．急性铅暴露对小鼠海马组织中PKC-γ蛋白表达的影响正常组小鼠海马在培养液培养前后PKC-γ表达基本保持不变，同浓度醋酸铅暴露的小鼠经过相应不同时间的染铅海马中PKC-γ表达与正常组相比有不同程度的变化。染铅组小鼠海马中PKC-γ表达在30和60min时分别有所下降，120 min后恢复到接近正常水平。2．急性铅暴露对小鼠海马中一氧化氮合酶活性的影响正常组小鼠海马在培养液培养前后一氧化氮合酶活性基本保持不变，同浓度醋酸铅暴露的小鼠经过相应不同时间的染铅海马中一氧化氮合酶活性与正常组相比有不同程度的变化。染铅组小鼠海马中一氧化氮合酶活性在30和60min时分别有所下降，120 min后恢复到接近正常水平。3．急性铅暴露对小鼠海马中一氧化氮的影响正常组小鼠海马在培养液培养前后一氧化氮含量基本保持不变，同浓度醋酸铅暴露的小鼠经过相应不同时间的染铅海马中一氧化氮含量与正常组相比有不同程度的变化。染铅组小鼠海马中一氧化氮含量在30和60min时分别有所下降，120min后恢复到接近正常水平。结论1．与正常组相比不同时间的铅暴露可引起PKC-γ的异常表达；在30和60min时分别有所下降，120 min后恢复到接近正常水平。2．与正常组相比不同时间的铅暴露可对一氧化氮合酶活性，一氧化氮含量有明显的影响；在30和60min时分别有所下降，120 min后恢复到接近正常水平。3．第一部分与第二部分得到的结果反映出，铅对小鼠脑细胞中的PKC-γ的表达和一氧化氮合酶活性，一氧化氮含量的影响规律基本一致，即在30和60min时分别有所下降，120 min后恢复到接近正常水平。这说明PKC-γ与一氧化氮合酶活性，一氧化氮含量两个途径并不是孤立的，铅对脑细胞的有害作用可能在这两个途径中持续循环放大。

全文目录

一、摘要  5-12
  中文摘要  5-9
  英文摘要  9-12
二、英文缩略语  12-13
三、论文  13-25
  前言  13-15
  材料与方法  15-17
  实验结果  17-21
  讨论  21-24
  结论  24-25
四、本研究创新性的自我评价  25-26
五、参考文献  26-32
六、附录  32-42
  1. 综述  32-40
  2. 在学期间科研成绩  40-41
  3. 致谢  41-42
  4. 个人简介  42

急性铅暴露对幼年大鼠脑海马中PKC-γ，NOS，NO的影响

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