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茶树花色素还原酶基因的克隆及其在E.coli中的表达

作　者: 郑华坤
导　师: 郑金贵
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 茶树花色素还原酶RACE 基因克隆原核表达
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

原花色素(proanthocyanidin，PA)具有很强的抗氧化能力，其清除自由基的能力分别为V_E的50倍和V_C的20倍。儿茶素类物质既是PA的构成单位，也是PA聚合的启动单位，在PA的形成中具有重要的作用。花色素还原酶(anthocyanidin reductase，ANR)的主要作用是将花青素、花葵素、花翠素等前体物质转化为相应的儿茶素类物质。因此，ANR在原花色素的生物合成过程中起重要作用。以本实验室自主选育的高EGCG茶树品系“1005”为材料，采用RACE的方法获得了茶树ANR的全长cDNA序列，扩增其开放阅读框，构建了pET-28a-ANR重组子在BL21中表达，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白。具体结果如下：1．获得了茶树花色素还原酶基因全长cDNA序列：用Tnzol试剂从茶树嫩芽中提取总RNA，根据不同植物花色素还原酶基因同源性较高的区域设计保守区引物，利用RT-PCR技术获得茶树花色素还原酶基因的保守序列。然后，根据测序结果设计引物扩增该基因的3′-和5′-端序列。拼接的全长cDNA序列(1260bp)通过DNAman推断其氨基酸序列。推断的氨基酸序列与茶树花色素还原酶，葡萄花色素还原酶，茶树无色花色素还原酶的一致性分别为99％，84％和83％。2．原核表达：设计茶树花色素还原酶基因开放阅读框的上、下游引物，扩增其开放阅读框，与pET-28a进行体外重组，然后在大肠杆菌BL21中表达，SDS-PAGE检测融合蛋白大小。结果表明，获得了高表达的预期大小(约45kDa)的融合蛋白。

全文目录

图表清单  7-8
缩略词表  8-9
摘要  9-10
Abstract  10-11
引言  11-12
Ⅰ 文献综述  12-29
  1 原花色素的组成及功能  12-16
    1.1 原花色素的组成  12
    1.2 原花色素的功能  12-16
      1.2.1 原花色素的保健功能  12-16
      1.2.2 原花色素在植物体内的生理功能  16
  2 原花色素生物合成途径研究现状  16-18
  3 花色素还原酶的研究进展  18-23
  4 RACE研究进展  23-29
    4.1 cDNA末端快速扩增技术  23-24
    4.2 RACE技术的原理  24-25
    4.3 RACE技术的改良  25-28
    4.4 RACE技术的应用  28-29
Ⅱ 材料与方法  29-42
  1 材料  29-30
    1.1 植物材料  29
    1.2 菌种  29
    1.3 酶及试剂盒等  29
    1.4 主要溶液  29
    1.5 主要仪器  29-30
    1.6 常用的生物信息分析的相关软件及网站  30
  2 方法  30-42
    2.1 植物材料的处理  30
    2.2 总RNA的提取和检测  30-31
      2.2.1 准备工作  31
      2.2.2 RNA抽提  31
      2.2.3 检测所抽提的RNA的质量  31
    2.3 目的基因RT-PCR  31-34
      2.3.1 RT-PCR  31-32
      2.3.2 目的片段回收  32
      2.3.3 将回收的目的片段连接到pMD18-Tvector  32-33
      2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)  33
      2.3.5 连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞  33
      2.3.6 PCR鉴定目的基因及测序  33-34
    2.4 3′-RACE获得目的基因的3′-端  34-35
      2.4.1 第一链cDNA的获得  34
      2.4.2 3′-RACE的PCR  34-35
      2.4.3 平末端目的片段末端加poly(A)  35
    2.5 5′-RACE获得目的基因的5′-端  35-38
      2.5.1 第一链cDNA的合成  35-36
      2.5.2 第一链cDNA的纯化  36
      2.5.3 纯化的cDNA加尾  36
      2.5.4 dC加尾的cDNA的PCR  36-38
    2.6 csANR基因的原核表达  38-42
      2.6.1 csANR基因ORF的克隆  38-39
      2.6.2 pET-28a空载体质粒提取  39-40
      2.6.3 pET-28a-csANR重组载体的构建  40
      2.6.4 连接产物产转化大肠杆菌  40
      2.6.5 重组质粒验证  40-41
      2.6.6 重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞及IPTG诱导  41
      2.6.7 SDS-PAGE验证目的蛋白  41-42
Ⅲ 结果与分析  42-50
  1 总RNA的提取  42-43
  2 茶树csANR基因全长cDNA的克隆  43-46
    2.1 扩增保守序列区域  43
    2.2 3′-RACE  43-44
    2.3 5′-RACE  44-46
    2.4 目的基因全长cDNA序列拼接及其序列分析  46
  3 原核表达  46-48
    3.1 ORF扩增及体外重组结果  46-48
    3.3 SDS-PAGE电泳结果  48
  4 小结  48-49
  5 讨论  49-50
    5.1 RNA提取  49
    5.2 原核表达  49-50
参考文献  50-58
致谢  58

茶树花色素还原酶基因的克隆及其在E.coli中的表达

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