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N-氨甲酰水解酶的分离纯化及固定化的初步研究

作　者: 李苏平
导　师: 韦萍；姚忠
学　校: 南京工业大学
专　业: 生物化工
关键词: N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶分离纯化性质固定化
分类号: TQ28
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

D-氨基酸广泛应用于医药等领域 ,它是合成抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂、杀虫剂以及拟除虫菊酯的重要中间体,特别是作为半合成抗生素的侧链原料, D-氨基酸 ,更受到学术界与产业界的关注。众所周知,随着致病菌耐药性的增强,抗生素的剂量不断提高,从而对人类导致一些意想不到的副作用。改造β-内酰胺类抗生素(如青霉素或头孢霉素)的侧链,不同侧链改变了细菌的耐药性 ,而其母核仍保持抗菌活性,这可能是克服抗生素使用剂量不断增大的一条有效途径。利用海因酶法生产D-氨基酸理论上可以达到100%的纯度。N-氨甲酰基氨基酸水解酶 (N-Carbamoylase,NCase)属于酰胺水解酶,它是具有严格的立体特异选择性水解N-氨甲酰基氨基酸生成具有光学活性的氨基酸,是海因酶法生产光学活性氨基酸的关键酶,其活性高低直接影响光学纯氨基酸的产率及转化效率。本论文对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行了初步研究,主要包括以下几个方面:1)N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行了分离纯化;2)对其性质进行了研究;3)对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶固定化的条件进行了优化并对固定化酶的性质进行了初步探讨。N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶(NCase)被纯化了15.74倍,收率为0.75%,纯化的收率和倍数较低,这可能因为Burkholderia cepecia Njut01中的NCase的含量不是很高,并且NCase容易氧化失活,造成较低的收率。SDS/PAGE该酶的亚基分子量是35 KDa。酶学性质研究表明,(1)Burkholderia cepecia Njut01 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶是严格的D-N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶,其初速度受底物浓度的影响,高浓度底物抑制NCase的酶活。(2)测定了基本动力学常数:当N-phe为底物时米氏常数Km=10.22mmol﹒L-1,最大反应初速度rm= 0.27mmol﹒L-1﹒min-1,最适的底物浓度约1.2 mg﹒mL-1。(3) Burkholderia cepecia Njut01 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的最适pH为7.2,最适温度为52℃。(4) Burkholderia <WP=5>cepecia Njut01 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶在空气中极易失活,解决NCase的失活问题将对利用NCase进行D-氨基酸生产有重要意义。(5) 研究了金属离子对NCase的影响。EDTA在20mmol.L-1时对NCase没有影响,表明N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶不属于金属酶。一价碱金属K+、Na+、Li+和二价的碱土金属Ca2+、Mg2+、Ba2+对酶有激活作用,重金属Cu2+、Hg2+对酶有强烈的抑制作用。过渡金属中除Mn2+有激活作用外,Zn2+、Co2+、Ni2+、Fe2+都对酶有抑制作用。(6)由巯基试剂对Burkholderia cepecia Njut01中的 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的研究可知,当加入不同浓度的修饰试剂时,酶活都有一定程度的抑制,因此,在催化过程中,该酶的巯基是必需的。对N-氨甲酰水解酶的固定化条件进行了优化。使用不同的方法(碳二亚胺法和环氧基载体法)固定化Burkholderia cepecia Njut01 中的NCase的酶活可以达到21.4%的收率。结果表明,固定化在4℃下进行20小时,蛋白浓度应确定为2mg﹒mL-1,对于氨化后的载体与酶固定化时的EDC的量应为500μL。研究了固定化的N-氨甲酰水解酶的基本性质,环氧基载体固定化酶和氨基载体固定化酶最适温度为60℃~65℃,最适pH8.5~9.0。固定化酶储存半衰期为六个月左右,转化的批次大约为10批。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章文献综述  12-24
  1.1 前言  12-13
  1.2 N-氨甲酰基-D-氨基酸水解酶的研究现状  13-16
    1.2.1 N-氨甲酰基-D-氨基酸水解酶的来源  13-14
    1.2.2 N-氨甲酰基-D-氨基酸水解酶的性质  14-15
    1.2.3 N-氨甲酰基- D-氨基酸水解酶的基础研究  15-16
  1.3 酶的分离纯化  16-19
    1.3.1 酶的粗分离  16-18
      1.3.1.1 细胞破碎及其碎片的分离  16-17
      1.3.1.2 酶的浓缩  17-18
    1.3.2 酶的精制  18-19
      1.3.2.1 凝胶过滤层析  18
      1.3.2.2 离子交换层析  18-19
      1.3.2.3 疏水层析  19
      1.3.2.4 亲和色谱  19
  1.4 酶固定化技术研究进展  19-23
    1.4.1 固定化酶简介  19-20
    1.4.2 固定化酶的方法  20-22
      1.4.2.1 吸附法  20-21
      1.4.2.2 包埋法  21
      1.4.2.3 交联法  21
      1.4.2.4 共价结合法  21-22
    1.4.3 各种固定化方法的比较  22-23
  1.5 本文工作的意义和主要研究内容  23-24
第二章 N-氨甲酰水解酶的分离纯化  24-34
  2.1 引言  24-25
  2.2 材料与方法  25-27
    2.2.1 主要试剂和仪器  25-26
      2.2.1.1 试剂  25
      2.2.1.2 主要仪器  25-26
    2.2.2 方法  26-27
      2.2.2.2 酶活测定  26
      2.2.2.3 蛋白总量测定  26
      2.2.2.4 电泳纯度鉴定分析  26-27
      2.2.2.5 氨基酸和N-氨甲酰氨基酸的检测  27
      2.2.2.6 纯化方法  27
  2.3 N-氨甲酰氨基酸水解酶的分离纯化  27-33
    2.3.1 细胞破碎  27-29
    2.3.2 (NH4)2SO4沉淀  29-30
    2.3.3 疏水层析  30
    2.3.4 G200分子筛凝胶过滤  30-31
    2.3.5 SOURCETM 15Q强阴离子交换  31-32
    2.3.6 纯化结果  32-33
  2.4 讨论  33
  2.5 本章小结  33-34
第三章 N-氨甲酰水解酶的酶学性质研究  34-43
  3.1 实验材料  35
    3.1.1 实验试剂  35
    3.1.2 实验仪器  35
  3.2 实验方法  35-36
    3.2.1 基本动力学常数Km及最大反应速度Vm的测定  35
    3.2.2 温度的对酶活影响  35-36
    3.2.3 最适pH测定  36
    3.2.4 酶的稳定性  36
    3.2.5 金属离子对酶活的影响  36
    3.2.6 巯基试剂对该酶催化的影响  36
  3.3 实验结果  36-42
    3.3.1 基本动力学常数Km及最大反应速度Vm的测定  36-38
    3.3.2 温度的对酶活影响  38
    3.3.3 最适pH测定  38-39
    3.3.4 EDTA对酶活的影响  39
    3.3.5 金属离子对酶活的影响  39-40
    3.3.6 酶的稳定性  40-41
    3.3.7 巯基试剂对酶活的影响  41-42
  3.4 本章小结  42-43
第四章 N-氨甲酰水解酶的固定化及其性质研究  43-55
  4.1 材料与方法  44-47
    4.1.1 主要试剂和仪器  44-45
    4.1.2 方法  45-47
      4.1.2.1 酶的制备  45
      4.1.2.2 游离酶活性的测定方法  45
      4.1.2.3 固定化酶活性的测定方法  45
      4.1.2.4 固定化酶的活力的回收  45
      4.1.2.5 固定化酶半衰期的测定  45-46
      4.1.2.6 环氧基载体的氨化  46
      4.1.2.7 EDC的配制  46
      4.1.2.8 固定化方法  46
      4.1.2.9 蛋白固定率的计算  46-47
  4.2 结果与讨论  47-51
    4.2.1 固定化时间的确定  47-48
      4.2.1.1 氨基载体固定化时间的确定  47-48
      4.2.1.2 环氧基载体固定化时间的确定  48
    4.2.2 酶液浓度的确定  48-51
      4.2.2.1 氨基载体固定化时蛋白浓度的影响  48-49
      4.2.2.2 环氧基载体固定时蛋白浓度的影响  49-50
      4.2.2.3 EDC量的确定  50-51
  4.3 固定化酶的性质研究  51-54
    4.3.1 固定化酶的最适作用pH值  51-52
      4.3.1.1 环氧基载体固定化酶的最适pH  51
      4.3.1.2 氨基载体固定化酶的最适pH  51-52
    4.3.2 温度对酶活性的影响  52-54
      4.3.2.1 温度对环氧基载体固定化酶的影响  52-53
      4.3.2.2 温度对氨基载体固定化酶的影响  53
      4.3.2.3 固定化酶的保存和使用稳定性  53-54
  4.4 结论  54-55
第五章结论与展望  55-57
  5.1 结论  55-56
  5.2 展望  56-57
参考文献  57-62
论文发表  62-63
致谢  63

N-氨甲酰水解酶的分离纯化及固定化的初步研究

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