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FMD鉴别诊断抗原3ABC的原核表达与纯化及RNAi抑制FMDV复制的初步研究

作　者: 任武泽
导　师: 孙世铎；尤永进
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: FMDV 鉴别诊断抗原3ABC 原核表达 RNAi 抑制病毒复制
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的偶蹄类动物烈性传染病，被国际兽疫局（Office International des Epizooties, OIE）列为A类传染病之首。疫苗接种是防治FMD爆发的主要措施之一，而要控制FMD流行，首先要将病毒感染动物从疫苗接种群体中区分开来。本文分为两部分，第一部分为：FMD鉴别诊断抗原3ABC的原核表达与纯化；第二部分为：RNAi 抑制FMDV复制的初步研究。第一部分在大肠杆菌表达并纯化FMDV非结构蛋白3ABC，旨在为研制FMDV感染和疫苗接种鉴别诊断试剂盒奠定基础。为构建表达载体，扩增了O型FMDV 3ABC片段，插入到原核表达载体pQE30Xa，利用PCR、双酶切和测序进行鉴定，成功构建了重组载体pQE3ABC；转化到M15(pREP4)和SG13009(pREP4)宿主菌中表达，表达产物经SDS-PAGE分析，大小为40kD左右，经Western-blot检测证明该融合蛋白可以与标准抗O型口蹄疫抗体发生特异性反应。优化了重组质粒pQE3ABC的表达条件，其结果为：氨苄青霉素和IPTG的适宜浓度分别为100μg/mL和1mM，在M15(pREP4)和SG13009(pREP4)两个宿主菌内表达差异不显著。利用镍离子亲和层析柱进行融合蛋白纯化，SDS-PAGE结果表明纯化产物较为单一。利用稀释复性法（超滤）对纯化的融合蛋白进行复性，并利用BCA-蛋白质定量测定试剂盒测得复性后的融合蛋白浓度为80-100μg/mL。本文第二部分为：利用RNAi抑制FMDV在BHK细胞中复制的初步研究，旨在为利用RNAi防治FMD做一些尝试。FMDV基因组为单股正链RNA，既可作为基因组复制的模板，又可作为mRNA进行蛋白质翻译，因而很适合于RNAi抗病毒的研究。根据FMDV IRES和L串联序列两侧的保守区域设计了两个引物，利用RT-PCR和PCR方法扩增出该串联序列，并进行测序。测序结果表明：IRES非常保守，未出现碱基差异；而L基因则出现了7个碱基突变。在测序的基础上，选择FMDV的毒力因子L作为靶基因，筛选位于启始密码子下游第229nt后21nt长的序列为靶位点，在体外利用PCR方法合成了siRNA表达盒（SEC）。细胞单层长成50-70%时，用脂质体将纯化的SEC-L229转染到BHK细胞中，转染4h后用FMDV接种细胞，24h后用间接免疫荧光方法检测口蹄疫病毒在BHK细胞中的复制情况。研究结果表明：SEC-L229以序列特异性方式极大地抑制了口蹄疫病毒在BHK细胞中的复制（>80%），并降低了BHK细胞的死亡率。25ng和50ng SEC-L229处理组间对病毒复制的抑制作用差异（剂量依赖性）不显著。本研究初步表明，利用PCR方法合成SEC快速、经济，SEC可特异性地抑制BHK细胞中FMDV的复制，RNAi技术可能为防治口蹄疫提供一个新的途径。

全文目录

第一部分 FMD鉴别诊断抗原3ABC的原核表达与纯化  11-43
  第一章口蹄疫病毒研究进展  11-17
    1.1 口蹄疫病毒基因组结构及基因表达  12-13
      1.1.1 口蹄疫病毒基因组结构  12
      1.1.2 口蹄疫病毒基因表达  12
      1.1.3 口蹄疫病毒结构蛋白及其功能  12-13
    1.2 口蹄疫病毒非结构蛋白及其功能  13-15
    1.3 非结构蛋白所引起的免疫反应  15
      1.3.1 体液免疫  15
      1.3.2 细胞免疫  15
    1.4 口蹄疫病毒的复制  15-17
      1.4.1 FMDV感染细胞的机制  15
      1.4.2 FMDV的翻译  15-16
      1.4.3 FMDV RNA的合成  16
      1.4.4 病毒颗粒的包装  16-17
  第二章口蹄疫疫苗及以NSPs为基础的诊断方法  17-23
    2.1 口蹄疫疫苗及NSPs  17
    2.2 口蹄疫病毒感染动物与NSPs抗体  17-18
    2.3 NSPs抗体作为口蹄疫病毒动物的标志  18-20
    2.4 基于检测NSPs抗体的鉴别诊断方法  20-23
  第三章试验研究  23-40
    前言  23
    3.1 3ABC表达载体构建  23-29
      3.1.1 试验材料与溶液配制  23-24
      3.1.2 试验方法  24-27
      3.1.3 结果  27-28
      3.1.4 讨论  28-29
    3.2 重组蛋白3ABC的表达与鉴定  29-36
      3.2.1 试验材料  29
      3.2.2 试验方法  29-32
      3.2.3 试验结果  32-35
      3.2.4 讨论  35-36
    3.3 重组蛋白3ABC的纯化  36-40
      3.3.1 主要仪器  36
      3.3.2 主要试剂  36
      3.3.3 试验方法  36-37
      3.3.4 试验结果  37-38
      3.3.5 讨论  38-39
      3.4 结论  39-40
  参考文献  40-43
第二部分 RNAi 抑制FMDV复制的初步研究  43-63
  第一章文献综述  43-52
    1.1 RNAi研究进展  43-49
      1.1.1 RNAi的发现  43-44
      1.1.2 RNAi的作用机制  44-46
      1.1.3 miRNA  46-48
      1.1.4 RNAi技术  48-49
    1.2 RNAi的应用  49-52
      1.2.1 基因功能研究  49
      1.2.2 基因治疗  49-50
      1.2.3 RNAi与遗传性疾病  50-51
      1.2.4 RNAi与其它反向遗传学技术的比较  51-52
  第二章试验研究  52-63
    前言  52
    2.1 试验材料  52
      2.1.1 主要仪器  52
      2.1.2 主要试剂  52
    2.2 试验方法  52-57
      2.2.1 总病毒RNA的提取  53
      2.2.2 引物的设计与合成  53
      2.2.3 RT-PCR  53-54
      2.2.4 IRES+L+串联序列的测序分析  54
      2.2.5 靶位点选择与寡聚核苷酸模板合成  54
      2.2.6 SEC的体外合成  54-56
      2.2.7 细胞培养  56
      2.2.8 转染  56-57
      2.2.9 细胞接毒  57
      2.2.10 间接免疫荧光检测  57
      5.2.11 荧光细胞记数  57
    2.3 试验结果  57-61
      2.3.1 IRES和L串联序列的扩增  57
      2.3.2 IRES和L串联序列测序分析  57-59
      2.3.3 SEC-L229的合成  59
      2.3.4 SEC-L229对FMDV复制的抑制效应  59-61
    2.4 讨论  61-62
    2.5 结论  62-63
致谢  63-64
参考文献  64-69
个人简介  69

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