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核桃蛋白酶解产物的活性初步探究

作　者: 闫凤
导　师: 孟庆雄
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 核桃蛋白酶解产物活性筛选分离纯化
分类号: TS201.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

我国的核桃资源非常丰富,其中所含的核桃蛋白是一种极优质的植物蛋白,除用于初级食品的制作外,还可作为食品基料或食品添加剂使用,应用前景广阔。目前,具有高附加值的核桃多肽已成为核桃蛋白的主要加工方向之一。生物活性肽是现今研究的热点活性物质之一,具有多种生理活性,而且与其它蛋白质类药物相比,它被机体吸收的效率更高,因此受到越来越多的关注。目前的研究主要是利用来源丰富的蛋白质通过蛋白酶水解来制备出大量具有活性的多肽。本论文选取核桃蛋白作为蛋白质来源,选用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶三种常用水解酶对核桃蛋白进行酶解,得到一系列酶解产物,并对酶解产物的活性进行了筛选。首先参考各种文献资料,确定三种蛋白酶的酶解条件,其中胰蛋白酶酶解条件为：加酶量E/S为1×104U/g,pH8.0,温度55℃,酶解时间8h；胃蛋白酶酶解条件为：pH 2,温度设定为37℃,加酶量E/S为1×104U/g,酶解时间8h；木瓜蛋白酶酶解条件为：pH8.0,温度55℃,加酶量E/S为1×104U/g,酶解时间8h。根据选定的酶解条件对核桃蛋白进行酶解,得到三种酶解产物：胰蛋白酶酶解产物(Y)、胃蛋白酶酶解产物(W)和木瓜蛋白酶酶解产物(M),并通过SDS-PAGE电泳对酶解产物的分子量进行了初步研究,发现三种酶解产物均为分子量在15KD以下的小肽,为后续的活性研究准备好了样品。接着对三种酶解产物(Y、W和M)进行了酶活性、血液活性、抑菌活性和抗肿瘤活性的筛选。结果表明：Y、W、M均具有一定的丝氨酸蛋白酶活性,无丝氨酸蛋白酶抑制活性；三种酶解产物中只能确定W具有一定的纤维蛋白原水解活性,并很有研究价值：W能水解纤维蛋白原的Aα、Bβ链；三种酶解产物均无磷脂酶A2活性及磷脂酶A2抑制活性；Y、W、M均具有一定的溶血活性,其中Y的溶血活性较高,溶血率高达199.33%,W和M的溶血率分别为47.49%和27.09%；三者均无红细胞凝集活性及血小板聚集活性；Y和M不具有血小板聚集抑制活性,而W的该活性较强,最大抑制率为70%左右；Y、W、M均对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和白色念球菌六种细菌无抑制作用；Y、M对Hela细胞的抑制效果不明显,抑制率低于20%,W对Hela细胞的抑制率可达到75%,抑制效果明显；三者对PC-12细胞的抑制率都不超过15%；W对MCF-7细胞的抑制率为40%,其它两者不明显；Y、W、M均对MDA-435细胞具有一定的抑制作用,抑制率分别为56.18%、71.45%和26.56%；三者对Hep G2细胞几乎没有抑制作用。最后对酶解产物的丝氨酸蛋白酶活性进行了初步研究,排除了丝氨酸蛋白酶水解活性中的多种干扰因素,包括反应体系、酶解底物等,基本确证了丝氨酸蛋白酶活性的存在；初步确定了三种蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳酶解时间；而且对M和W进行了初步的分离纯化,M分别选用Sephadex G-75、Sephadex G-25凝胶层析,W选用了Sephadex G-25凝胶层析和Sephadex C-25离子交换层析两种方法,结果得到了12个组分：MG-75Ⅰ、MG-75Ⅱ、MG-25Ⅰ、MG-25Ⅱ、MG-25Ⅲ、MG-25Ⅳ、WG-25Ⅰ、WG-25Ⅱ、WC-25Ⅰ、WC-25Ⅱ、WC-25Ⅲ、WC-25Ⅳ,但在对这12个组分进行丝氨酸蛋白酶活性的筛选过程中发现,各组分均不具有该活性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
插图和附表清单  12-14
第一章文献综述  14-26
  1.1 核桃仁中各种营养成分的研究现状  14-19
    1.1.1 核桃仁中的脂类物质  15-16
    1.1.2 核桃蛋白  16-18
    1.1.3 核桃仁种皮  18-19
  1.2 生物活性肽的研究进展  19-24
    1.2.1 生物活性肽的定义及分类  19-20
    1.2.2 生物活性肽的功用  20-23
    1.2.3 生物活性肽的制备方法  23
    1.2.4 生物活性肽的分离纯化  23-24
  1.3 立题意义  24-25
  1.4 研究内容  25-26
第二章核桃蛋白酶解产物的初步制备  26-36
  2.1 前言  26
  2.2 材料与仪器  26-27
    2.2.1 材料  26-27
    2.2.2 主要仪器  27
  2.3 实验方法  27-29
    2.3.1 核桃蛋白的预处理  27-28
    2.3.2 酶解条件的初步设定  28-29
    2.3.3 核桃蛋白酶解工艺  29
    2.3.4 核桃蛋白酶解多肽的预处理  29
    2.3.5 酶解多肽分子量分析  29
  2.4 结果及讨论  29-34
    2.4.1 核桃蛋白的预处理  29-30
    2.4.2 酶解条件的设定  30-32
    2.4.3 核桃蛋白酶解  32
    2.4.4 酶解液的预处理  32-33
    2.4.5 酶解多肽分子量分析  33-34
  2.5 本章小结  34-36
第三章核桃蛋白酶解产物的酶活性筛选  36-56
  3.1 前言  36-37
  3.2 材料与仪器  37-38
    3.2.1 材料  37-38
    3.2.2 主要仪器  38
  3.3 实验方法  38-43
    3.3.1 丝氨酸蛋白酶水解活性筛选  38-39
    3.3.2 丝氨酸蛋白酶抑制活性筛选  39-40
    3.3.3 纤维蛋白原水解活性筛选  40-41
    3.3.4 磷脂酶A_2(PLA_2)活性筛选  41-42
    3.3.5 磷脂酶A_2(PLA_2)抑制活性筛选  42-43
  3.4 结果及讨论  43-55
    3.4.1 丝氨酸蛋白酶水解活性  43-47
    3.4.2 丝氨酸蛋白酶抑制活性  47-49
    3.4.3 纤维蛋白原水解活性  49-53
    3.4.4 磷脂酶A_2(PLA_2)活性  53-54
    3.4.5 磷脂酶A_2(PLA_2)抑制活性  54-55
  3.5 本章小结  55-56
第四章核桃蛋白酶解产物的血液活性筛选  56-66
  4.1 前言  56
  4.2 材料与仪器  56-57
    4.2.1 材料  56
    4.2.2 主要仪器  56-57
  4.3 实验方法  57-60
    4.3.1 溶血活性检测  57-58
    4.3.2 红细胞凝集活性检测  58-60
    4.3.3 血小板聚集与聚集抑制实验  60
  4.4 实验结果及讨论  60-65
    4.4.1 溶血活性  60-62
    4.4.2 红细胞凝集活性检测  62-63
    4.4.3 血小板聚集与聚集抑制活性  63-65
  4.5 本章小结  65-66
第五章核桃蛋白酶解产物的抑菌及抗肿瘤活性筛选  66-80
  5.1 前言  66-67
  5.2 材料与仪器  67-69
    5.2.1 材料  67-68
    5.2.2 主要仪器  68-69
  5.3 实验方法  69-72
    5.3.1 抑菌活性筛选  69-70
    5.3.2 抗肿瘤活性筛选  70-72
  5.4 实验结果及讨论  72-79
    5.4.1 酶解产物的抑菌活性  72-73
    5.4.2 酶解产物的抑制肿瘤细胞生长活性  73-79
  5.5 本章小结  79-80
第六章核桃蛋白酶解产物丝氨酸蛋白酶活性的初步研究  80-94
  6.1 前言  80
  6.2 材料与仪器  80-81
    6.2.1 材料  80-81
    6.2.2 主要仪器  81
  6.3 实验方法  81-84
    6.3.1 酶解产物丝氨酸蛋白酶活性的确证  81-83
    6.3.2 酶解产物的初步分离纯化  83-84
    6.3.3 酶解产物分离组分的活性研究  84
  6.4 实验结果及讨论  84-93
    6.4.1 酶解产物丝氨酸蛋白酶活性的确证  84-89
    6.4.2 酶解产物的初步分离纯化  89-93
    6.4.3 酶解产物分离组分的丝氨酸蛋白酶活性检测  93
  6.5 本章小结  93-94
总结与讨论  94-96
致谢  96-97
参考文献  97-102
附录A 在读期间已发表的论文  102-103
附录B SDS-PAGE电泳实验操作步骤  103-105
附录C 细胞实验中主要溶液的配制方法  105-106

核桃蛋白酶解产物的活性初步探究

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