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诱导表达细胞CaM对烟草抗逆性的调控效应及其生理生化机制

作　者: 杨静
导　师: 龚明
学　校: 云南师范大学
专　业: 环境科学
关键词: 钙调素抗氧化酶钙信使系统转基因烟草谷胱甘肽还原酶 RT-PCR 叶圆片
分类号: S572.01
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 102次
引　用: 3次
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内容摘要

根据CaM在植物生命活动中的多重作用，我们实验室已经建成了四套诱导性表达CaM/CaMBP的转基因烟草体系，以期利用人工调控CaM的方法更深入的研究CaM本身的功能和CaM与植物抗逆性、抗氧化酶系统之间的关系。本研究的结果主要分为三个部分：第一部分是利用改进的磷酸二酯酶法测定了16个诱导表达细胞质CaM的转基因烟草株系的CaM活性，从中筛选出五个能良好诱导表达的转基因烟草株系（1C、2C、8C、4L和7L）；然后深入研究了Tc诱导48小时过程中CaM活性的动态变化。此部分不仅筛选出了进行下一步研究的备试材料，还确定了诱导表达的适宜时间。第二部分是利用第一部分检测到的五个诱导表达细胞质CaM的转基因烟草株系进行抗热性和抗冷性的研究。结果不仅证实经过Tc诱导的转基因烟草比未经Tc诱导的转基因烟草的抗冷和抗热性更强，而且还证明非诱导状态下比未转化的空白对照（HO2020）抗性强。在我们用2C作进一步抗氧化酶研究的实验中发现：我们测定的五种抗氧化酶（SOD、GR、APX、GPX和CAT）在正常状态下就表现出诱导状态的转基因烟草比非诱导的酶活性强，而非诱导状态的转基因烟草又比空白对照（HO2020）强。在高温和低温胁迫后，虽然酶活都比正常状态下的有所下降，但是下降后的趋势仍然保持诱导的比非诱导的高，非诱导的比空白对照（HO2020）高。这样就比较清楚的证明了细胞质CaM的增加提高了植物的抗逆性，而这种抗逆性的提高又是通过CaM对抗氧化酶活性增强性的调控来介导完成的。第三部分是分析诱导表达细胞质CaM转基因烟草对谷胱甘肽还原酶基因表达和酶活性的调控。基于第二部分Tc诱导使抗氧化酶活性增强的<WP=7>启示，我们除了使用原有的GR酶活性测定方法以外，还采用了半定量的RT-PCR技术分析GR酶基因表达的强弱。结果发现GR基因的表达量与GR酶活性的高低相配合，都表现为：诱导表达细胞质CaM的转基因烟草比非诱导的强，且在诱导过程中逐渐增加；非诱导的比空白对照（HO2020）的强，但是这种增强不随时间延长而变化。所以我们认为进入细胞核的CaM对GR基因表达也有调控作用。

全文目录

缩写表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
I引言  10-17
II材料与方法  17-22
  一、植物材料  17
  二、处理方法  17-18
    1、 Tc诱导  17
    2、低温处理  17
    3、高温处理  17-18
  三、测定方法  18-22
    1、 CaM的提取  18
    2、 CaM的测定  18-19
    3、无机磷的测定  19
    4、蛋白质的测定  19
    5、烟草幼苗或离体叶圆片电解质渗漏率的测定  19
    6、烟草幼苗或离体叶圆片TTC活力测定  19
    7、抗氧化酶的提取和活性测定  19-21
    8、总RNA的提取  21
    9、 GR基因的半定量RT-PCR  21-22
  四、试剂与仪器  22
III实验结果  22-50
  一、诱导表达细胞质CaM转基因烟草的筛选  22-26
    1、转基因烟草诱导一天或两天的检测结果  22-25
    2、 Tc诱导48小时内5个诱导上调的株系的CaM动态变化  25-26
  二、诱导上调细胞质CaM水平对烟草抗逆性的效应  26-45
    1、转基因烟草幼苗的抗逆性分析  26-37
    2、转基因烟草叶圆片的抗逆性分析  37-38
    3、逆境下转基因烟草（2C）的五种抗氧化酶活性变化  38-45
  三、诱导表达细胞质CaM对烟草谷光甘肽还原酶基因表达和酶活性的调控  45-50
    1、 Tc诱导24小时内转基因烟草叶圆片CaM的动态变化  45
    2、 Tc诱导24小时内转基因烟草叶圆片GR酶的动态变化  45
    3、用RT-PCR方法分析诱导表达细胞质CaM对烟草GR基因表达的调控  45-50
IV讨论  50-54
  一、诱导表达细胞质CaM转基因烟草各株系间的CaM表达差异  50-51
  二、 Tc诱导表达系统的表达渗漏问题  51
  三、诱导表达细胞质CaM对植物抗逆性的调控及与抗氧化系统的的关系  51-53
  四、利用定量RT-PCR方法分析CaM对烟草GR基因表达的调控  53-54
结束语  54-55
参考文献  55-66
致谢  66-67
附录：用磷酸二酯酶定量检测植物钙调素方法的改进  67-71

诱导表达细胞CaM对烟草抗逆性的调控效应及其生理生化机制

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