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突变型hGM-CSF基因的克隆及其在甲醇酵母（pichia pastoris）中表达的研究

作　者: 杨红
导　师: 蔡绍皙；欧阳克清
学　校: 重庆大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 突变型hGM-CSF 克隆 甲醇酵母 分泌表达
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 53次
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内容摘要


人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Human Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor,hGM-CSF)是由127个氨基酸组成的造血生长因子。hGM-CSF主要生物学功能是刺激造血前体细胞的增殖、分化和增强成熟效应细胞（主要是中性粒细胞、嗜酸性细胞和单核/巨嗜细胞）。在临床上主要用于骨髓移植、癌症、AIDS、白细胞减少等病症的辅助治疗。但在治疗中还存在许多未尽人意之处，如比活性低，治疗时用量大，循环半衰期短等缺点。临床实验表明，酵母系统表达的hGM-CSF与大肠杆菌体系表达的hGM-CSF相比，具有较小的毒性和副反应发生率。天然hGM-CSF由于糖基化程度不同，分子量从14.5-32KD不等。根据相关文献报道，临床试验表明未糖基化的hGM-CSF的生物活性更高。由此，我们实验室利用引物导入点突变的方法，从人胎肝cDNA文库中钓出该基因并突变了其中的两个糖基化位点,即把9-Ser10-Thr变为9-Ala10-Ala。经限制性酶切鉴定和DNA序列分析证明，获得与设计一致的突变型hGM-CSF基因片段。将该基因片段克隆至酵母中间质粒载体pPIC9K质粒上，通过转化大肠杆菌TOP10F’，扩增重组质粒，将带hGM-CSF基因的重组质粒线性化后，导入甲醇酵母(Pichia Pastoris)宿主系统，与酵母染色体同源重组，只有重组酵母菌株能利用His4-培养基，由此特性排除非重组菌株。利用毕赤酵母抗G418的特性，梯度筛选得到多拷贝高表达的工程菌。并对工程菌表达条件的优化做了一些初步的探索。本实验以野生型hGM-CSF基因在毕赤酵母中表达作对照。甲醇酵母(Pichia Pastoris)是一种新型外源基因表达系统，易于操作，具有真核生物的特性，有许多优点：含有诱导型启动子，用甲醇可以严格地调控表达；外源基因多拷贝重复整合到酵母染色体上，表达稳定；可以胞外分泌表达，外源蛋白可以直接分泌到培养基中，有利于维持其天然构型、生物活性及下游的分离纯化；生存能力强，培养基成本较低廉，发酵工艺成熟，生物量大，易于实现高密度、高表达及大规模培养，甚至放大至工业化规模进行生产。本实验中，我们成功地将hGM-CSF基因导入毕赤酵母中高效表达。我们尝试对其潜在的O-糖基化位点9-Ser、10-Thr作了突变，该突变型基因表达的产物分子量约为14.7KD，Western Blot显示具有天然分子的免疫原性和生物活性，其表达量为100mg/L左右。这个结果还将有助于对毕赤酵母在表达后修饰及其糖基化问题作进一步研究。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-11
1 前言  11-22
  1．1 hGM-CSF研究  11-17
    1．1．1 hGM-CFS的产生  11-12
    1．1．2 hGM-CFS的基因结构和蛋白特性  12-13
    1．1．3 hGM-CSF的生物学活性  13-14
    1．1．4 hGM-CSF的受体  14-15
    1．1．5 hGM-CSF的临床应用  15
    1．1．6 国内外rhGM-CSF研究和开发概况  15-17
  1．2 外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究概况  17-20
    1．2．1 P．Pastoris是一种甲醇营养型酵母  18
    1．2．2 外源蛋白的分泌  18
    1．2．3 常用的表达菌株  18-19
    1．2．4 质粒载体  19-20
    1．2．5 高密度发酵的探索  20
  1．3 本文的主要工作  20-21
  1．4 选题依据和意义  21-22
2 实验方法  22-31
  2．1 质粒和菌株  22-23
    2．1．1 质粒和菌株  22
    2．1．2 培养基和培养  22
    2．1．3 酶与试剂  22
    2．1．4 仪器  22-23
  2．2 实验方法  23-31
    2．2．1 PCR扩增hGM-CSF基因和Mutant hGM-CSF基因  23
    2．2．2 PCR产物的回收与纯化  23
    2．2．3 PCR产物的酶切  23
    2．2．4 PCR产物酶切后的回收  23-24
    2．2．5 质粒pPIC9K的酶切反应  24
    2．2．6 连接与转化  24-25
    2．2．7 质粒的大量及小量制备  25
    2．2．8 转化毕赤甲醇酵母  25-26
    2．2．9 细胞内G418抗性筛选高拷贝转化菌株  26-27
    2．2．10 PCR法筛选转化子克隆  27
    2．2．11 重组酵母菌株的表达  27
    2．2．12 SDS--PAGE电泳检测酵母表达的目的蛋白  27-28
    2．2．13 Western Blot抗原特异性检测  28-29
    2．2．14 重组及野生型GM---CSF的分离纯化  29
    2．2．15 蛋白质浓度的测定  29
    2．2．16 重组及野生型GM-CSF生物活性测定  29
    2．2．17 重组变异GM-CSF发酵工艺的研究  29-31
3 实验结果  31-47
  3．1 hGM-CSF分泌型表达载体的构建、克隆与鉴定  31-39
    3．1．1 hGM-CSF分泌型表达载体的构建  31-36
    3．1．2 hGM---CSF重组克隆的鉴定  36-39
  3．2 筛选转化毕赤甲醇酵母的转化子及高表达菌株  39-43
    3．2．1 毕赤甲醇酵母转化子的筛选  40-41
    3．2．2 高表达菌株的抗性筛选  41-42
    3．2．3 hGM-CSF基因在毕赤酵母中的分泌表达  42-43
  3．3 表达产物的Western Blot检测  43
  3．4 影响hGM-CSF基因分泌表达因素的初步研究  43-47
    3．4．1 分泌表达曲线  43-45
    3．4．2 转接量与诱导培养方式的改变对表达的影响  45
    3．4．3 转接量与诱导培养方式的改变对表达的影响  45-46
    3．4．4 培养液增加缓冲能力后对分泌表达的影响  46
    3．4．5 消泡剂对分泌表达的影响  46-47
4 讨论  47-53
  4．1 外源蛋白分泌表达的优点、限制因素及对策  47-51
    4．1．1 外源蛋白分泌表达的优点  47-48
    4．1．2 影响外源蛋白分泌表达的因素  48-51
  4．2 细胞因子发展的新趋势-融合蛋白  51-53
5 小结  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-59
附录  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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