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抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究

作　者: 徐飞虎
导　师: 龚兴国
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 单链抗体绿色荧光蛋白分子标记原核表达
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

绿色荧光蛋白作为一种新型的标记分子，可应用于活体细胞的实时检测。目前已有相当多的文献报道关于将GFP基因与特定抗体或细胞因子基因结合进行融合表达的研究，证明融合蛋白具有GFP的荧光性质和配体蛋白质的生物功能，可用于对肿瘤的检测、药物筛选、细胞因子受体的分布以及功能等方面的研究，应用前景广阔。目前国内关于将绿色荧光蛋白与其他细胞因子融合表达的报道较少。相关的报道有抗肝癌单链抗体融合GFP在真核细胞中的表达，以及重组IL-18-GFP融合蛋白活性研究等。本论文拟将抗肺癌单链抗体连接绿色荧光蛋白进行融合表达，预期目标蛋白应同时具有抗体活性及光激发绿色荧光双重功能。本实验经PCR方法从mRNA逆转录产物中克隆到抗肺癌抗体的重链可变区和轻链可变区，并利用重叠延伸PCR方法将其构建为单链抗体scfv形式。利用酶切连接将scfv基因序列插入到绿色荧光蛋白基因3’-端构成gfp-scfv重组基因，并转化大肠杆菌表达。经IPTG诱导表达后并SDS-PAGE蛋白电泳，与阴性菌对照，在预期分子量范围内出现一明显条带。利用Ni-NTA树脂纯化蛋白，出现两个明显的峰。SDS-PAGE电泳分析表明，其中一个峰的蛋白条带符合预期蛋白分子量。396nm激发显示绿色荧光，证实目的基因在宿主中得到表达。不过，表达出的蛋白是否具有抗体活性还需要进一步的分析研究。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
第一部分绿色荧光蛋白研究进展  6-29
  前言  7-9
  1 、绿色荧光蛋白的理化性质  9-11
  2 、绿色荧光蛋白的化学结构和发光机制  11-17
    2.1 绿色荧光蛋白的化学结构  11-12
    2.2 野生型绿色荧光蛋白的发光机制  12-15
    2.3 突变型GFP的发光机制  15-17
      2.3.1 Ⅰ型突变  15
      2.3.2 Ⅱ型突变  15-16
      2.3.3 Ⅲ型突变  16-17
  3 、绿色荧光蛋白在生物技术中的应用  17-24
    3.1 分子标记  17-19
      3.1.1 基因表达的报告  17-18
      3.1.2 在细胞生物学中作为荧光标记用于细胞动态的研究  18-19
      3.1.3 活细胞内蛋白的定位研究  19
    3.2 GFP在信号转导中的应用  19-21
    3.3 药物筛选  21-22
    3.4 融合抗体  22-23
    3.5 生物传感器  23-24
  4 、展望  24-25
  参考文献  25-29
第二部分抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究  29-58
  前言  30-32
  1 、实验材料和仪器  32-36
    1.1 菌种及质粒  32
    1.2 酶  32
    1.3 各种试剂盒  32
    1.4 缓冲液及其他溶液  32-33
    1.5 培养液和固体培养基  33-34
    1.6 其它主要试剂和商品来源  34-35
    1.7 电泳胶  35
    1.8 PCR引物  35
    1.9 主要仪器  35-36
  2 、方法  36-39
  3 、结果  39-52
    3.1 抗体重链和轻链可变区的克隆  39-40
    3.2 重链和轻链的序列测定  40-41
    3.3 VL基因的修饰  41-42
    3.4 单链抗体的构建  42-45
    3.5 Pro319质粒的构建  45-46
    3.6 gfp-scfv基因构建  46-49
    3.7 gfp-scfv基因在大肠杆菌的表达  49-52
  4 、讨论  52-55
  参考文献  55-58
附录1 Pava319质粒序列  58-62
附录2 英文缩写词表  62-63
致谢  63

抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究

内容摘要

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