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重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的表达和免疫原性研究

作　者: 李学义
导　师: 朱平
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 类风湿性关节炎 Ⅱ型胶原多肽重组人Ⅱ型胶原25O-27O多肽 T细胞增殖口服耐受流式细胞术细胞因子
分类号: R593.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种累及滑膜组织的自身免疫性疾病，在我国成人中的发病率约为0.3％。其临床特点为累及到周身关节的增殖性和侵蚀性滑膜炎，呈进行性病变且终生反复发作、迁延不愈，自发性缓解极为罕见，被认为是类似“局限性恶性肿瘤”的破坏性病变，至今尚无特效治疗。因此，探索RA治疗的新途径，发展低毒、有效和特异性免疫制剂并研究其治疗机制是临床医学亟待研究的一个重要课题和发展趋势。 RA的发病机理虽然不清，但其发病与外周关节中隔离的自身蛋白被识别而导致的周围性耐受功能异常密切相关。关节软骨组织中的Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen，CⅡ)是与RA发病、发展有关的最重要的自身抗原之一，其T细胞表位主要位于CB11片段上的CⅡ260—270(IAGFKGEQGPK)。近年来的研究揭示，化学合成的包含该片段的较大片段如CⅡ250-270较小片段多肽具有更强的免疫活性和耐受原性，比CⅡ具有更高的特异性和安全性。但化学合成多肽技术复杂、代价昂贵、产量少，无法满足基础和临床应用的需要，而采用DNA重组技术生产的多肽产品则可以很好的解决这一问题。因此，本研究利用基因工程的方法重组、表达了人CⅡ功能性多肽CⅡ250-270(recombinant human collagen type Ⅱ peptide 250-270，第。＊区夭含硕士研究主伦义rh C 11 250《70X 经分离、纯化并进一步验证其初步具有预期的免疫学活性。本研究利用基因工程及分子生物学技术将含有人 C 11 250刁70多聚基因的表达载体 PGEX－4T－1（由本实验室提供）转化 E COlt BLZll程菌，融合表达目的蛋白，经Glutathione Sepharose”4B亲和层析柱分离纯化，12％聚丙烯酷胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析和凝胶薄层扫描测量其分子量和纯度。实验结果显示，融合表达的目的产物经SDS干AGE分析大小约为43 KD，与预期相符。分离纯化的 6聚扣 C 11 250－270经沁S－PAGE凝胶薄层扫描，纯度为 89％，浓度为 2．ling／ffil。为了进一步验证汁 C 11 250－270是否具有同化学合成的引＊ 250－270相似的免疫学活性，本研究建立了一种用流式细胞仪同时测定T淋巴细胞增殖与细胞因子分泌的方法。本方法可以同时检测细胞表面活化抗原的表达、DNA合成及胞内细胞因子的分泌，能够分析不同亚群细胞对于不同刺激原的反应和激活表型，敏感性高、重复性好，可在单细胞水平检测单个核细胞的增殖和功能性激活。以不同浓度（0．l、1．0、10、100、1000 u g／ml）的6聚NCll250－270刺激体外培养的趴患者 PBMC和 SFMC，等浓度的“T蛋白和 PBS作为阴性对照，PMA和化学合成的 C 11 250－270刺激组作为阳性对照。流式细胞仪测定刺激前后各组培养细胞中T细胞表面活化标志性抗原uD69，CD2引的表达、5－溪脱氧尿啼睫mrdU）在 DNA中的掺入及细胞因子 IFN－Y和 IL4的分泌，以验证其对RA患者特异性T细胞的活化作用。FCM结果显示：rh C11250－270合适的刺激浓度为100pm／ml，共同孵育4 d后，RA（19例）患者 PBMC和 SFMC T细胞中 CD69、CD25表达率、BrdU在洲A中的掺入率及胞内细胞因子IL－4、IFN－Y分泌细胞比率均显著高于同行对照GST 组（P＜0．of），而和化学合成 Cll250－270刺激组无统计学差异（P＞0．05）。进一步分析，同组患者滑液中CD69的表达率显著高于外周血（P＜0．of），提示 8 涕。零氏丈《硕十研究主伦上重组、表达的人 Cll 250－270多肽在体外具有活化 RA患者特异性 T细胞、促使其增殖并分泌相应的细胞因子的特性，初步具有预期的免疫学活性。为进一步探讨 MHCI类分子在特异性 T细胞活化中的作用，本研究采用敏感性较高的特异性引物法，对RA患者和健康对照组m4基因及其亚型进行分析。结果表明RA患者DR4基因的阳性率显著高于正常人，基因亚型以DRBI＊0405为主。在 rhC 11 250－270多肽反应阳性的 19例 RA患者中，DR4阳性17例，亚型仍以mBI＊0狈5为主，提示CH250－27O多肽激活特异性T细胞的过程受MHC的限制，即DR4分子特别是含有“共有序列”的亚型可能参与了Cll多肽的免疫反应过程。本研究构建了 HuC 11 250－270的多聚基因并表达、分离、纯化了 6聚 rhC JI 250－270多肽。经初步验证：rhC 11 250－270在体外具有活化 RA患者特异性T细胞的特性，初步具有预期的兔疫学活性，为口服耐受治疗RA的基础和临床研究提供了研究材料和实验依据。

全文目录

英文缩略词表  6-8
英文摘要  8-12
中文摘要  12-15
前言  15-16
文献回顾  16-46
  一、类风湿关节炎发病机理的研究  16-25
  二、类风湿关节炎免疫治疗新途径  25-32
  三、口服耐受的诱导和机理  32-37
  四、 Ⅱ型胶原蛋白与类风湿关节炎  37-46
研究内容  46-78
  第一部分 rhCⅡ250-270多肽的表达及纯化  46-53
    一、材料与方法  46-50
    二、结果  50-51
    三、讨论  51-53
  第二部分流式细胞术检测淋巴细胞增殖方法的建立  53-62
    一、材料与方法  53-56
    二、结果  56-59
    三、讨论  59-62
  第三部分 rhCⅡ250-270多肽对RA患者特异性T细胞的活化  62-71
    一、材料与方法  62-65
    二、结果  65-69
    三、讨论  69-71
  第四部分 RA患者HLA-DR4基因及其亚型的检测  71-78
    一、材料与方法  71-74
    二、结果  74-76
    三、讨论  76-78
小结  78-79
致谢  79-80
参考文献  80-91
附录  91-92

重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的表达和免疫原性研究

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