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TIM1-TIM4相互作用对小鼠过敏模型中CD4~+CD25~+调节性T（Treg）细胞功能的影响

作　者: 王新亭
导　师: 郑鹏远
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: 食物过敏 CD4~+CD25~+调节性T细胞口服耐受 TIM蛋白树突状细胞
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景及目的近年来,过敏性疾病特别是食物过敏(food allergy, FA)的发病率在全球内迅速增加,目前约有2%-6%的人有食物过敏及相关症状。FA的症状轻则表现为呕吐、腹泻、呼吸困难、皮疹等不适,重则发生威胁生命的过敏性休克。最近几年有关食物过敏领域的研究进展迅速,但其发病机制仍不清楚,当前普遍认为FA是肠道免疫系统与食物抗原之间的耐受平衡被打破,产生的以Th2细胞反应为主的免疫反应。正常情况下,肠道免疫系统对食物抗原和肠道共生菌能够产生耐受,肠道上皮完整性、树突状细胞(dendritic cell, DC)和调节性T细胞等对维持这种平衡至关重要。CD4+CD25+-调节性T(Treg)细胞是调节性T细胞重要的一个亚型,在抗感染、移植耐受、口服耐受及自身免疫病中发挥重要作用,其功能紊乱或数目下降将导致肠道免疫耐受失衡。鼠和人的Treg能选择性表达叉头翼螺旋转录因子(Foxp3),表达Foxp3的Treg细胞在维持免疫耐受的作用已被证实,Foxp3的基因突变或表达下降,可导致Treg细胞的功能不全。然而,Treg在FA中的功能状态及作用机制仍未明了。T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin and mucin domains, TIMS)2001年首先在小鼠中发现,包括TIM1-TIM8,在人基因组中也发现有同源类似分子(TIM1、TIM3、TIM4)。TIMS家族的基因多态性与自身免疫性疾病、过敏性疾病及Th1-Th2细胞间的平衡作用受到人们重视。小鼠CD4+T细胞表达TIM1, TIM4是它的配体,表达于成熟的DC,高表达的TIM4与TIM1结合能够打破Th1-Th2细胞平衡,促进Th2细胞炎症因子释放,并产生相应炎症反应。TIM1在调节Treg的功能中也显示出重要作用,在体外实验中已证实,TIM1的激活能够降低Treg细胞Foxp3、糖皮质激素诱发型肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor, GITR)和其他Treg细胞表面分子的mRNA及其功能。目前对FA中的Treg的功能状态及TIM1对其影响尚未见报道,我们推测FA中也存在Treg细胞功能不全,TIM4与TIM1的相互作用可能降低Treg细胞的功能及状态,破坏免疫耐受平衡,是造成FA的重要机制之一。本研究通过构建金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B, SEB)+卵清蛋白(ovalbumin, OVA)食物过敏小鼠模型,检测FA状态下Treg的功能,并用TIM1抗体和TIM4抗体干预,对TIM1对Treg功能的影响和FA的发病机制做进一步探讨。使用SEB和OVA致敏BALB/c小鼠模型,通过测定小鼠的空肠及脾脏Foxp3 mRNA表达及TGF-β1和IL-10抑制性细胞因子水平,了解Treg在FA中的功能状态；使用TIM1和TIM4抗体干预,研究在FA中TIM4-TIM1通路对Treg功能的影响。材料和方法无受试蛋白喂养BALB/c小鼠32只,随机分为4组：空白对照组,SEB+OVA共同作用组,TIM1抗体干预组,TIM4抗体干预组,分别于0、3、9日腹腔注射生理盐水,SEB和OVA,TIM1抗体+SEB+OVA,TIM4抗体+SEB+OVA,并于第7、14日给SEB+OVA(空白对照组以生理盐水灌胃)灌胃。小鼠腹泻为造模成功标志,如果被致敏小鼠未出现明显腹泻,可观察处死后小鼠的肠道内容物,相对于正常小鼠结肠中的球样大便,水样粪便亦可被视为腹泻。最后灌胃24小时后处死小鼠,并进行相关指标的检测。1 ELISA法测定血清OVA sIgE与IL-4。2 RT-PCR检测空肠及脾脏Foxp3 mRNA表达。3 RT-PCR检测空肠TIM4 mRNA表达。4 ELISA法测定血清TGF-β1和IL-10。5免疫组化方法检测空肠粘膜TGF-β1与IL-10表达。6 HE染色检测空肠粘膜嗜酸性粒细胞数目。所得数据均采用SPSS13.0统计软件包进行分析。组间均值比较采用单因素方差分析,以α=0.05为假设检验标准。结果1与空白对照组小鼠相比,SEB+OVA过敏小鼠OVA sIgE(P<0.05)及IL-4(P<0.05)明显升高,嗜酸性粒细胞明显增多(P<0.05)。2与空白对照组小鼠相比,SEB+OVA过敏小鼠空肠及脾脏Foxp3表达明显减少(0.401±0.145 vs 0.732±0.162, P=0.000; 0.407±0.082 vs 0.691±0.145, P=0.000),TIM1和TIM4抗体干预组空肠及脾脏Foxp3表达较过敏组小鼠明显恢复(P均<0.05),与空白对照组接近。3与空白对照组小鼠(0.485)相比,SEB+OVA(0.615)、TIM1(0.606)和TIM4(0.578)抗体干预组小鼠TIM4表达较高(P=0.004,P=0.007,P=0.033),抗体干预组之间表达无明显差异。4与空白对照组小鼠相比,SEB+OVA过敏小鼠的血清及空肠TGF-β1(7859.853±126.704 vs 8342.814±488.461, P<0.05; 108.834±9.634 vs 156.298±12.002, P<0.05)表达明显减少,TIM1和TIM4抗体干预组血清及空肠TGF-β1较过敏组小鼠明显恢复(P均<0.05)。5与SEB+OVA过敏小鼠相比,TIM1和TIM4抗体干预组OVA sIgE及IL-4明显恢复,嗜酸性粒细胞数目减少(P均<0.05),与空白对照组接近。结论1 SEB+OVA刺激可以促进小鼠食物过敏发生。2 SEB+OVA过敏小鼠存在空肠及脾脏Foxp3表达下降,且存在血清及空肠TGF-β1表达下降,提示过敏小鼠存在调节性T细胞功能不全,Treg的功能不全在小鼠食物过敏发生中起重要作用。3 SEB+OVA刺激可以促进小鼠TIM4表达增高。4 TIM1和TIM4抗体干预能够改善Treg的功能,改善过敏症状,提示TIM1-TIM4通路在小鼠食物过敏发生中起重要作用。

TIM1-TIM4相互作用对小鼠过敏模型中CD4~+CD25~+调节性T（Treg）细胞功能的影响

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