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HIF-1α/SDF-1轴在低氧诱导祖细胞迁移和粘附中的作用

作　者: 李梅
导　师: 敖启林
学　校: 华中科技大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 低氧 低氧诱导因子-1α 间质细胞衍生因子 祖细胞 迁移 粘附
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


研究目的初步探讨低氧诱导因子-1α/间质细胞衍生因子-1（hypoxia-inducible factor-1alpha/ stromal cell-derived factor-1, HIF-1α/SDF-1）轴在低氧诱导祖细胞迁移和粘附至肺动脉内皮细胞中的作用,以期进一步了解肺血管重塑可能的分子和细胞学机制,进而为低氧性肺动脉高压的治疗提供新思路。方法以SD大鼠外周血祖细胞和SD大鼠肺动脉内皮细胞为研究对象,实验按下列步骤进行:1、SD大鼠外周血祖细胞的动员、分离和鉴定:粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员外周血祖细胞、免疫磁珠分离纯化SD大鼠外周血CD34/CXCR4阳性祖细胞、免疫荧光和流式细胞仪（FCM）鉴定CD34/CXCR4阳性祖细胞纯度。2、SD大鼠肺动脉内皮细胞的分离纯化培养:组织块贴壁法分离纯化SD大鼠肺动脉内皮细胞。3、收集常氧和不同低氧时间点6h、12h和24h的肺动脉内皮细胞:1)免疫荧光检测HIF-1α和SDF-1的表达情况;2)Western-blot检测HIF-1α蛋白表达情况;3)ELISA检测细胞培养上清液中SDF-1表达情况;4)ELISA检测HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇（2ME2）抑制HIF-1α后SDF-1的表达;4、HIF-1α/SDF-1轴在祖细胞迁移中的作用1)实验分为以下几组:①常氧组:21%O2, 5%CO2, 74%N2②低氧12h组:1%O2, 5%CO2, 94%N2③低氧12h+ HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇（2ME2）组④低氧12h+抗SDF-1组⑤低氧12h+HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇（2ME2）+抗SDF-1组2)将CD34/CXCR4阳性祖细胞接种于已贴好趋化滤膜的上层小室,将各组肺动脉内皮细胞条件培养液置于下室,孵育6h,去掉滤膜正面（上面）的细胞,甲醇固定,计数滤膜背面（下面）的细胞数。计算公式为:迁移指数（Migration Index）=实验组每10个HPF平均细胞数/对照组每10个HPF平均细胞数5、HIF-1α/SDF-1轴在祖细胞粘附中的作用:1)实验分为以下几组:①常氧组:21%O2, 5%CO2, 74%N2②低氧12h组:1%O2, 5%CO2, 94%N2③低氧12h+ HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇（2ME2）组④低氧12h+抗SDF-1组⑤低氧12h+ HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇（2ME2）+抗SDF-1组2)将单层培养的各组肺动脉内皮细胞与荧光标记的CD34/CXCR4阳性祖细胞接种于96孔板,共同孵育6h,洗涤未粘附细胞,检测荧光强度（用OD值表示）,计算细胞粘附率。设肺动脉内皮细胞孔和祖细胞孔为对照。公式为:粘附率=实验组OD值-肺动脉内皮细胞对照组OD值/祖细胞对照组OD值×100%结果1、免疫磁珠分离大鼠外周血CD34/CXCR4祖细胞:形态学:镜下见细胞几乎全粘附磁珠,形似淋巴细胞大小,直径约7-10μm;免疫荧光染色:CD34/CXCR4阳性;流式细胞检测CD34/CXCR4阳性细胞纯度为91%;2、纯化培养的肺动脉内皮细胞呈多边形,Ⅷ因子阳性表达于胞质,CD34阳性表达于胞膜;3、低氧诱导肺动脉内皮细胞HIF-1α表达,表达部位在细胞核,常氧时无明显表达;低氧诱导肺动脉内皮细胞SDF-1表达,表达部位在细胞质和细胞膜,常氧时无明显表达;4、低氧诱导肺动脉内皮细胞HIF-1α蛋白的表达: Western-blot检测HIF-1α蛋白在低氧12h组（0.791±0.027）明显高于常氧组（0.035±0.001,P<0.01）;低氧12h组表达高于低氧6h组（0.568±0.032）和24h组（0.432±0.016）（P<0.01）;5、低氧诱导肺动脉内皮细胞SDF-1的表达:ELISA检测低氧12h组（331.874±20.989pg/ml）细胞培养上清液SDF-1的表达明显高于常氧组（18.621±3.323pg/ml,P<0.01）;低氧6h（258.453±30.170pg/ml）和24h（125.267±25.341pg/ml）组SDF-1的表达高于常氧组（P<0.05）;6、用HIF-1α抑制剂阻断可下调SDF-1的表达:用HIF-1α抑制剂的低氧12h组SDF-1表达（41.053±9.770pg/ml）明显低于未用HIF-1α抑制剂组（P<0.05）;7、用HIF-1α抑制剂或者SDF-1相应抗体均可以使CD34/CXCR4阳性祖细胞向肺动脉内皮细胞的迁移指数和粘附率下降。结论低氧可诱导肺动脉内皮细胞HIF-1α及受其调控的下游因子SDF-1的表达。HIF-1α/SDF-1轴在介导祖细胞迁移和粘附至肺动脉内皮细胞的过程中起重要作用,提示其可能是低氧肺血管重塑的一个重要机制。

全文目录


中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
材料和方法  15-27
实验结果  27-31
讨论  31-33
附图  33-39
小结  39
结论  39-40
参考文献  40-45
综述  45-58
  参考文献  52-58
主要缩略词表  58-59
致谢  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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