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黄蓝状菌Talaromyces flavus内切β-1，3-葡聚糖酶的纯化、特性及抗菌活性

作　者: 杨勇
导　师: 李多川
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 黄蓝状菌Talaromyces flavus 内切β-1 3-葡聚糖酶产酶条件纯化性质
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

近年来，化学农药的“3R”（resistance, residual and resurgence）问题日益突出，生物防治作为病害综合治理的一个重要环节，与可持续农业有良好的相融性和一致性，已在世界范围内受到人们的极大关注。菌寄生是菌寄生真菌（Mycoparasites）与寄主真菌之间的一种寄生方式，是自然界普遍存在的一种真菌-真菌之间的相互作用。菌寄生菌与寄主真菌相互作用过程中，可诱导产生一系列的胞外细胞壁降解酶类（如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶、脂酶等），降解并穿透寄主真菌的细胞壁。因此，菌寄生菌是一类具有重要的理论和应用价值的真菌，它们不仅对植物病害有防治潜力，而且对阐明真菌间的寄生现象及信号传导有重要意义。黄蓝状菌（Talaromyces flavus）是一种常见的菌寄生真菌，对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等多种病原菌产生的菌核有重寄生作用，此外对大丽轮枝菌（Verticillum dahliae）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）等有明显的抑制作用。黄蓝状菌与寄主真菌互作中，诱导产生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶等多种胞外水解酶和葡萄糖氧化酶。由于大多数真菌的细胞壁是由几丁质和β-1,3-葡聚糖组成的，因而几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶被认为是一类重要的抗真菌蛋白。本研究表明黄蓝状菌T. flavus经诱导培养，可产生至少3种细胞壁降解相关的酶，即几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶，但该菌不产生蛋白酶；各酶诱导产生的高峰并不一致，β-1,3-葡聚糖酶在培养7d后达到高峰，而几丁质酶和纤维素酶则需9~10d。黄蓝状菌T. flavusβ-1,3-葡聚糖酶的诱导培养基，碳源可选用适当病原菌的细胞壁碎片，但高浓度的葡萄糖对产酶有强烈的抑制作用；氮源以酵母膏为最佳。产酶最适培养温度为28~30℃；培养基初始pH对产酶有较大影响，产酶适宜pH范围为5.0~6.0，最适宜pH为5.5。黄蓝状菌在SMF（Synthetic medium with fungal cell walls as carbon sources）液体培养基中置于恒温摇床（200r/min，28℃）上培养7d，诱导产生大量的β-1,3-葡聚糖酶。培养滤液经硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow<WP=8>阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析得到了凝胶电泳（SDS-PAGE）谱带单一的β-1,3-葡聚糖酶。经12% SDS-PAGE和凝胶过滤层析，测得其分子量约为41.0~42.6kD。糖染色反应即过碘酸-Schiff试剂染色表明, 纯化的β-1,3-葡聚糖酶为单链糖蛋白。经薄层层析进一步证明，该酶为内切β-1,3-葡聚糖酶。本研究对β-1,3-葡聚糖酶的基本性质及其抑菌活性进行了测定，结果表明：β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度为40℃，最适pH值范围为4.0~4.5之间。β-1,3-葡聚糖酶热稳定性较差，当温度超过45℃，酶开始丧失部分活性；60℃保温30min，其活性仅为原来的20%；在酸碱稳定性方面，pH< 6.5时酶较稳定，反应的最适pH值为4.0~4.5，当pH = 4.5时活性最高。Michaelis-Menten动力学分析得出，纯化的β-1,3-葡聚糖酶Km、Vmax分别为1.74mg/mL和0.176mg/mL·min。Na2+、Ca2+、Mn2+等对β-1,3-葡聚糖酶具有一定的激活作用，Hg2+、Cu2+、Ag+等对该酶具有强烈的抑制作用。抗菌活性显示，β-1,3-葡聚糖酶对供试病原菌具有不同程度的抑制作用，其中对烟草赤星病菌、核盘菌和黄瓜枯萎病菌的抑制作用明显；而对串珠镰刀菌和苹果炭疽病菌抑制作用微弱。

全文目录

1 引言  5-27
  1．1 β-葡聚糖酶的研究概况  12-17
  1．2 β-1,3-葡聚糖酶与植物抗真菌病害  17-27
2 黄蓝状菌细胞壁降解相关酶系的诱导研究  27-34
  2．1 材料与方法  27-30
  2．2 结果与分析  30-34
3 黄蓝状菌内切β-1,3-葡聚糖酶的纯化、性质及抗菌活性  34-51
  3．1 材料与方法  34-41
  3．2 结果与分析  41-51
4 讨论  51-59
  4．1 黄蓝状菌细胞壁降解相关酶系的诱导  51-53
  4．2 黄蓝状菌内切β-1,3-葡聚糖酶的纯化、性质及抗菌活性  53-59
5 结论  59-60
6 黄蓝状菌β-1,3-葡聚糖酶后续研究工作  60-61
主要参考文献  61-70
致谢  70-71
附录1: 图版  71-75
附录2：研究生期间发表的论文  75

黄蓝状菌Talaromyces flavus内切β-1，3-葡聚糖酶的纯化、特性及抗菌活性

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