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齐口裂腹鱼肝胰脏中胰蛋白酶的纯化、性质及酶解动力学的研究

作　者: 郭娟
导　师: 李英文
学　校: 重庆师范大学
专　业: 动物学
关键词: 齐口裂腹鱼胰蛋白酶纯化性质酶解动力学
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti),隶属于鲤科(Cyprinidae),裂腹鱼亚科(Schizothoracinae),裂腹鱼属(Schizothorax)。广泛分布于长江上游、金沙江、岷江、大渡河及乌江下游等水域,是中国特有的冷水性鱼类。本实验从酶学水平上对齐口裂腹鱼胰蛋白酶的纯化,性质以及酶解动力学消化酶进行了研究,对于研究鱼类消化生理不仅具有重要意义,而且也能够为鱼类配合饲料开发提供相关的理论支持。1.齐口裂腹鱼胰蛋白酶的纯化齐口裂腹鱼的纯化采用三步法：盐析,离子交换色谱法和亲和色谱法。首先将齐口裂腹鱼断脊处死,取出肝胰脏,用4℃双蒸水淋洗干净,用滤纸吸干并称重,按照1：4(W/V)加入含有0.02%叠氮化钠50mM Tris-HCl(4℃、pH8.0)缓冲液,匀浆,过夜激活,然后离心取上清液。上清液用20-60%硫酸铵进行盐析,然后冷冻离心30min (11000rpm,4℃),用相同的缓冲液将沉淀溶解。然后将溶解液进行透析。透析后的粗酶液采用色谱法纯化,首先采用离子交换色谱法,离子交换填料使用Amersham公司的DEAE-SepharoseTM Fast Flow (1.2×20 cm),用含0-0.5 MNaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱,将有胰蛋白酶活性的洗脱峰收集。然后再经亲和色谱进行纯化,亲和色谱使用的是HiTrap Benzamidine FF (high sub)亲和预装柱,用pH3.0的甘氨酸缓冲液洗脱,将有胰蛋白酶活性的洗脱峰收集。采用Bradford法测定各收集组分的蛋白质含量,采用Worthington法测定各收集组分的胰蛋白酶活性,计算产率以及纯化倍数。实验结果显示；齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最终产率为18.1%,纯化倍数为456倍。2.齐口裂腹鱼胰蛋白酶性质研究将纯化后的胰蛋白酶进行SDS-PAGE电泳,电泳图最终显示为单一条带,用Bio-Rad凝胶成像系统测得齐口裂腹鱼的胰蛋白酶分子量为25.2KDa。以BAPNA为底物,测得其的米氏常数为0.136mM。设置不同的温度和pH值,采用Worthington法测得齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最适反应温度为20℃,最适反应pH为8.0,活性在20℃以下较稳定,pH在7.0-9.0范围内较稳定。用金属离子和抑制剂处理取纯化后的齐口裂腹鱼胰蛋白酶30min,经Worthington法测定显示：Ca2+对齐口裂腹鱼的酶活性有强烈抑制作用。Na+、K+随浓度的提高对齐口裂腹鱼胰蛋白酶的活性具有先激活后抑制的作用。Mg2+、Cu2+对齐口裂腹鱼的酶活力有激活作用。苯甲脒、PMSF、EDTA对齐口裂腹鱼胰蛋白酶活性有抑制作用,其中EDTA具有强烈的抑制作用。而β-巯基乙醇对齐口裂腹鱼胰蛋白酶有激活作用。3.齐口裂腹鱼胰蛋白酶蛋白分解活性的研究在离体条件下测定了纯化的齐口裂腹鱼胰蛋白酶对酪蛋白、牛血清白蛋白、菜粕、棉粕、豆粕和鱼粉的离体消化率和酶解动力学。结果显示,其酶解速度为：鱼粉>菜粕>酪蛋白>豆粕>棉粕>牛血清白蛋白。齐口裂腹鱼胰蛋白酶对酪蛋白的干物质消化率最高,对豆粕干物质消化率最低。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-11
1 绪论  11-17
  1.1 齐口裂腹鱼生物学基础  11-12
    1.1.1 分类和形态特征  11-12
    1.1.2 习性特征  12
    1.1.3 食性特征  12
    1.1.4 繁殖特点  12
  1.2 鱼类胰蛋白酶的研究  12-17
    1.2.1 鱼类胰蛋白酶分离纯化的研究  12
    1.2.2 鱼类胰蛋白酶的性质研究  12-13
    1.2.3 影响鱼类胰蛋白酶活性的因素  13-14
    1.2.4 离体消化率的研究  14-15
    1.2.5 研究鱼类胰蛋白酶活性的意义  15-17
2 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的纯化  17-27
  2.1 材料  17
    2.1.1 实验材料  17
    2.1.2 主要试剂  17
    2.1.3 主要仪器  17
  2.2 实验方法  17-21
    2.2.1 粗胰蛋白酶提取  17-20
    2.2.2 胰蛋白酶纯化  20-21
  2.3 结果与分析  21-24
    2.3.1 考马斯亮蓝标准曲线  21-22
    2.3.2 盐析最佳浓度的确定  22-23
    2.3.3 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的分离纯化  23-24
  2.4 讨论  24-27
    2.4.1 粗胰蛋白酶的提取  24
    2.4.2 盐析  24-25
    2.4.3 离子交换色谱  25-26
    2.4.4 亲和色谱  26-27
3 齐口裂腹鱼胰蛋白酶性质的研究  27-37
  3.1 实验材料  27
  3.2 实验方法  27-29
    3.2.1 齐口裂腹鱼胰蛋白酶分子量的测定  27
    3.2.2 齐口裂腹鱼胰蛋白酶米氏常数(Km)的测定  27-28
    3.2.3 齐口裂腹鱼胰蛋白酶最适温度  28
    3.2.4 齐口裂腹鱼胰蛋白酶最适pH  28-29
    3.2.5 齐口裂腹鱼胰蛋白酶热稳定性  29
    3.2.6 齐口裂腹鱼胰蛋白酶酸碱稳定性  29
    3.2.7 金属离子和抑制剂对齐口裂腹鱼胰蛋白酶活性影响  29
  3.3 结果与分析  29-33
    3.3.1 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的分子量  29-30
    3.3.2 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的动力学常数  30
    3.3.3 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最适温度  30-31
    3.3.4 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最适pH  31
    3.3.5 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的热稳定性  31-32
    3.3.6 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的酸碱稳定性  32
    3.3.7 金属离子和抑制剂对齐口裂腹鱼胰蛋白酶活性的影响  32-33
  3.4 讨论  33-37
    3.4.1 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的分子量  33-34
    3.4.2 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的米氏常数  34-35
    3.4.3 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最适反应温度和热稳定性  35
    3.4.4 齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最适pH和酸碱稳定性  35-36
    3.4.5 金属离子和抑制剂对齐口裂腹鱼胰蛋白酶的影响  36-37
4 齐口裂腹鱼胰蛋白酶酶解动力学的研究  37-43
  4.1 材料  37
  4.2 实验方法  37-39
    4.2.1 酶解动力学研究  37-38
    4.2.2 消化能力测定  38-39
    4.2.3 统计分析  39
  4.3 结果与分析  39-41
    4.3.1 氨基酸标准曲线  39
    4.3.2 胰蛋白酶对蛋白质酶解的氨基酸生成量随时间的变化曲线  39-40
    4.3.3 酶解氨基酸生成量的回归方程及氨基酸的生成速度  40
    4.3.4 齐口裂腹鱼胰蛋白酶对蛋白质的离体消化率  40-41
  4.4 讨论  41-43
    4.4.1 胰蛋白酶对蛋白质的酶解动力学  41-42
    4.4.2 胰蛋白酶对蛋白质的离体消化率  42-43
结论  43-44
参考文献  44-50
缩写词  50-51
致谢  51-52
附录  52-53

齐口裂腹鱼肝胰脏中胰蛋白酶的纯化、性质及酶解动力学的研究

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