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粘球菌孤立分泌素基因的功能研究

作　者: 李杰
导　师: 刘红；李越中
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 粘球菌 Ⅱ型蛋白分泌系统分泌素胞外蛋白质组
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

以DKl622为模式菌株的黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)是一类具有复杂发育周期和多细胞行为如细胞密度依赖性生长、群体运动和捕食、子实体形态发生等的G-细菌(Shimkets,1990)。这些特性不仅受到包括胞外基质和细胞间信号等在内的胞外功能的调控,也同时依赖于M. xanthus细胞间或M. xanthus细胞与其他底物间的直接接触。M. xanthus可以向环境中分泌大量的胞外降解酶类,如蛋白酶、溶菌酶、酰胺酶和葡糖胺酶等(Hart & Zahler,1966; Sudo & Dworkin,1972),但却尚未鉴定出相应的基因和蛋白信息。序列分析显示,M.xanthus DK1622基因组编码有蛋白穿越质膜所需的所有分泌系统及一套完整的型蛋白分泌系统(T2SS) (Goldman et al,2006;Konovalova et al.,2010),提示其拥有蛋白分泌的巨大潜力。但迄今为止尚没有关于粘细菌胞外蛋白质组成和调控的系统研究报道。Myxococcus fulvus HW-1是本课题组分离的一株海洋耐盐粘球菌,在陆地和海洋生境下存在不同的生活模式(Zhang YQ et al.,2005).实验室前期研究中发现,外膜蛋白(Omp)基因Omp031的表达在其不同发育模式下存在显著差异。M.xanthus DK1622中其同源基因Mxan3106的缺失导致突变株耐盐能力和生孢率显著提高(Pan HW et al.,2009).生物信息学分析显示,Omp031及Mxan3106均是T2SS中的分泌素(secretin)编码基因,但却是独立于各自基因组中T2SS编码基因簇之外的孤儿基因(orphan gene)。鉴于DKl622中Mxan3106的多功能性,我们推测Omp031可能负责HW-1在特殊生长条件下特殊蛋白的分泌,进而在其不同生长发育模式的转换间发挥作用。对其功能的深入研究将成为粘球菌分泌蛋白质组研究的良好切入点。基于以上分析,本论文主要开展了以下工作：1、对M. fulvus HW-1的电转化条件进行了优化,证实外源DNA的摄取并非限制该菌株遗传操作的瓶颈因素。在实验室前期建立的基于随机转座质粒pMiniHimar 1-lacZ的HW-1电转化体系的基础上(Zhang CY et al,2007),以基于pBJl13的同源重组载体为材料,分别从电压、质粒浓度及构象、培养基及培养条件等多方面进行了优化。在所研究的条件下,均未能获得相关基因的敲除突变体,但却均可以获得HW-l的随机转座突变体。王静等人也证实粘球菌可以通过自然转化方式摄取外源DNA (Wang J et al.,2011)。据此推测,限制HW-1遗传操作的瓶颈不是由于其对外源DNA的转化能力低,而是由于其本身DNA重组或限制修饰系统的限制,使得电转化进入胞内的敲除载体无法通过同源重组整合入细菌染色体。但目前仅限于推测,具体的机制还需要系统的深入研究。2、在DK1622中构建了Mxan3106的全基因缺失突变株YLl601,并对比分析了其与部分缺失突变株YL0401的基本性质。与野生株DKl622相比,YLl601的运动能力没有显著变化,但耐盐生长能力提高、捕食能力降低,这些特征与YL0401的表现一致；但在子实体发育能力上,两株突变株却出现了明显差异：YLl601无论是在普通TPM平板上还是在海水TPM平板上的发育能力都明显弱于野生菌DKl622,而YL0401则正好相反。其中的原因尚待进一步研究。3、建立了粘球菌胞外蛋白制备方法,利用2-DE技术分离并比较分析了DKl622与YLl601的胞外蛋白质组,筛选鉴定7个Mxan3106特异的分泌蛋白。通过对文献中报道方法的改进,建立了适于粘球菌胞外蛋白提取和纯化的三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法；利用优化的双向电泳参数,对不同培养条件下野生株DKl622及突变体YLl601的胞外蛋白样品进行了分离。通过图谱比较分析,筛选23个DKl622中特有的蛋白点进行质谱鉴定。其中21个蛋白点得到鉴定。初步分析表明在已经鉴定的18个蛋白中,有7个蛋白预测为胞外蛋白,包括肽酶和金属磷酸酯酶。以上结果不仅证实了Mxan3106的分泌素功能,也为粘球菌胞外蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
符号说明及缩写  11-13
第一章文献综述  13-28
  1.1 粘细菌概述  13-14
  1.2 粘细菌的捕食行为  14-17
  1.3 细菌的蛋白分泌系统  17-25
    1.3.1 细菌的蛋白分泌系统概述  17-21
    1.3.2 细菌的Ⅱ型分泌系统  21-23
    1.3.3 粘细菌的蛋白分泌系统  23
    1.3.4 粘细菌的Ⅱ型蛋白分泌系统  23-25
  1.4 海洋粘细菌的研究  25-26
  1.5 本论文工作开展的思路及研究内容  26-28
第二章:橙色粘球菌HW-1遗传操作体系条件摸索  28-46
  2.1 实验材料  29-32
    2.1.1 菌株及质粒  29
    2.1.2 培养基  29-30
    2.1.3 实验试剂及仪器耗材  30-32
  2.2 实验方法  32-39
    2.2.1 目的基因缺失载体构建的流程  32-38
    2.2.4 HW-1野生菌株电转化条件的探索  38-39
      2.2.4.1 比较不同海水浓度液体CTT培养基中HW-1的生长状态  38
      2.2.4.2 HW-1的电转化  38-39
  2.3 实验结果与分析  39-45
    2.3.1 敲除载体的构建结果  39-41
    2.3.2 HW-1野生菌株的电转化  41-45
      2.3.2.1 比较不同海水浓度液体CTT培养基中HW-1聚团的强弱  41-42
      2.3.2.2 不同海水浓度和转速培养对HW-1电转化效率的影响  42-43
      2.3.2.3 不同电场强度对HW-1电转化效率的影响  43-44
      2.3.2.4 其他参数对HW-1电转化效率的影响  44-45
  本章小结  45-46
第三章 :DK1622孤立分泌素基因的功能研究  46-95
  3.1 实验材料  48-52
    3.1.1 菌株及质粒  48
    3.1.2 培养基  48
    3.1.3 实验试剂及仪器耗材  48-52
    3.1.4 分析软件及网站  52
  3.2 实验方法  52-65
    3.2.1 引物设计与信息  52-53
    3.2.2 基因缺失载体构建  53
    3.2.3 基因置换载体的构建  53-55
    3.2.4 M.xanthus DK1622突变株的筛选纯化  55-56
    3.2.5 M.xanthus DK1622突变株的基本性质分析  56-58
      3.2.5.1 不同海水浓度下子实体发育及生孢能力分析  56-57
      3.2.5.2 不同海水浓度下菌株的运动能力分析  57
      3.2.5.3 不同海水浓度下生长曲线的变化  57-58
      3.2.5.4 不同海水浓度下捕食能力的分析  58
    3.2.6 胞外蛋白质组分析  58-65
      3.2.6.1 样品的制备  58-59
      3.2.6.2 蛋白纯化(Bio-rad clean-up Kit)  59-60
      3.2.6.3 蛋白浓度测定  60-61
      3.2.6.4 双向电泳操作方法(按照Bio-rad双向电泳操作手册)  61-64
      3.2.6.5 染色  64
      3.2.6.6 考染蛋白胶内酶解  64-65
      3.2.6.7 蛋白质谱鉴定  65
  3.3 实验结果与分析  65-93
    3.3.1 基因缺失载体的构建  65-71
      3.3.1.1 Mxan3106基因敲除载体的构建  65-67
      3.3.1.2 Mxan2514基因敲除载体的构建  67-69
      3.3.1.3 基因置换载体的构建  69-71
    3.3.2 突变株的筛选及纯化  71-75
      3.3.2.1 Mxan3106及Mxan2514全基因敲除突变体的构建  71-72
      3.3.2.2 Mxan2514置换Mxan3106突变体的构建  72-75
    3.3.3 Mxan3106全基因缺失突变株YL1601的基本性质分析  75-82
      3.3.3.1 不同海水浓度下子实体发育及生孢能力分析  75-76
      3.3.3.2 不同海水浓度下菌株的运动能力分析  76-79
      3.3.3.3 不同海水浓度下生长曲线的测定  79-80
      3.3.3.4 不同海水条件下捕食能力分析  80-82
    3.3.4 胞外比较蛋白质组学实验  82-93
      3.3.4.1 蛋白标准曲线的测定  82
      3.3.4.2 胞外分泌蛋白样品的制备与2-D分离  82-86
      3.3.4.3 细胞膜相连蛋白的分离鉴定  86-89
      3.3.4.4 YL1601与DK1622在15%海水条件下比较蛋白质组学实验(培养液中的分泌蛋白)  89-93
  本章小结  93-95
总结  95-96
附录  96-97
参考文献  97-102
致谢  102-103
攻读硕士期间主要研究成果  103-104
学位论文评阅及答辩情况表  104

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