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粘细菌mRNA差异表达法研究及耐盐粘球菌HW-1的mRNA差异表达分析

作　者: 龚勋
导　师: 李越中
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 原核生物 mRNA差异表达 RNA随机引导PCR 粘细菌 耐盐粘球菌HW-1
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


寻找差异表达的基因是从分子角度分析包括分化、发育、癌症发生在内的生命过程的一个热点。Liang和Pardee于1992年首先报道并发展的mRNA差异显示技术(Differential Display,DD)是一种分析真核生物基因表达变化的有力工具。经典的差异显示技术是根据绝大多数真核细胞mRNA的3′端具有的多聚腺苷酸Poly(A)尾结构设计的,采用一套寡聚脱氧胸腺嘧啶(oligo dT)锚定引物将具有Poly(A)结构的mRNA反转录成cDNA。近年来,差异显示技术也被应用于定量分析环境刺激对于细菌基因表达的影响。一般的策略是基于RNA随机引导PCR(RAP—PCR)的方法,以一个或者两个随机引物代替一个随机引物和一个oligo-dT锚定引物,用于逆转录以及扩增缺少poly(A)尾的细菌mRNA。 Myxococcus fulvus HW-1(ATCC BAA-855,ATCC菌种保藏编号)是从海水样品中分离得到的一株耐盐粘球菌。与普通的陆生粘细菌不同,HW-1能够在0-130%的海水浓度的培养基上生长,其最适生长浓度为0-80%的海水培养基。HW—1的生长、形态和分化发育随着海水培养基盐浓度的改变而发生变化。高海水浓度培养条件下的HW—1的细胞生长没有密度依赖性,而低海水浓度(10%或更低)培养条件下的细胞生长具有一定的密度依赖性。相比低盐浓度培养条件下HW一1的粘孢子,高盐浓度培养条件下的HW—1生成的粘孢子具有更高的耐热能力。HW—1的这种随着海水盐浓度变化而变化的特殊细胞行为,非常令人感兴趣并值得进一步探讨。 传统的粘细菌遗传分析方法,比如转导、电转化和接合的效率很低,非常耗时。本文首次将mRNA差异显示技术作为一种新的粘细菌的分子遗传学分析方法,运用RAP—PCR技术寻找和分离淡水以及50%的海水培养条件下HW—1的差异表达基因。本文的主要内容包括: 1.建立了粘细菌mRNA差异显示的技术流程。通过实验比较,确立了SV Total RNA Isolation systerm(Promega)作为粘细菌总RNA提取的最优方法。通过统计学分析,从粘球菌DK1622基因组编码区域高频率分布的寡核苷酸序列中,

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
第一部分 前言  9-24
  1．1 粘细菌概述以及耐盐粘细菌HW-1  9-11
    1．1．1 粘细菌概述  9
    1．1．2 耐盐粘细菌HW-1  9-11
  1．2 原核生物的mRNA差异显示分析  11-19
    1．2．1 mRNA差异显示分析  11-13
    1．2．2 原核生物mRNA差异显示分析的一般方法  13-14
    1．2．3 原核生物mRNA差异显示分析随机引物的选择  14-16
    1．2．4 原核生物的mRNA差异显示的应用实例  16-18
    1．2．5 原核生物mRNA差异显示分析的应用研究展望  18-19
  1．3 RNA规则  19-22
    1．3．1 RNase的性质  19
    1．3．2 常用的RNase抑制剂  19-20
    1．3．3 创造一个无RNase的环境  20-22
  1．4 本实验的立题依据和基本思路  22-24
    1．4．1 立题依据  22
    1．4．2 基本思路  22-24
第二部分 粘细菌mRNA差异表达法研究  24-44
  2．1 实验材料和试剂  24
    2．1．1 实验材料  24
    2．1．2 试剂  24
  2．2 实验方法和操作步骤  24-29
    2．2．1 总RNA的提取  25-27
    2．2．2 随机引物的选择和设计  27-28
    2．2．3 随机引物的验证  28-29
  2．3 结果与讨论  29-43
    2．3．1 总RNA的提取  29-32
    2．3．2 从文献中选择的随机引物及验证  32-33
    2．3．3 根据粘球菌DK1622基因组信息设计随机引物和验证  33-43
  2．4 小结  43-44
第三部分 耐盐粘细菌HW-1 mRNA差异表达分析  44-77
  3．1 实验材料和试剂  44-45
    3．1．1 实验材料  44
    3．1．2 试剂  44-45
  3．2 实验方法和操作步骤  45-54
    3．2．1 总RNA的提取  45
    3．2．2 mRNA的富集  45-46
    3．2．3 RAP-PCR  46-47
    3．2．4 差异条带的回收，再扩增与克隆  47-51
    3．2．5 部分差异条带的转化子测序  51
    3．2．6 Reverse Northern Blot  51-54
  3．3 实验结果与讨论  54-76
    3．3．1 总RNA的提取  54
    3．3．2 mRNA的富集  54-56
    3．3．3 RAP-PCR的结果  56-59
    3．3．4 差异条带的回收，再扩增与克隆  59-62
    3．3．5 测序结果与分析  62-71
    3．3．6 Reverse Northern Blot  71-76
  3．4 小结  76-77
第四部分 总结与展望  77-80
  4．1 总结  77-79
  4．2 展望  79-80
参考文献  80-85
致谢  85-86
攻读学位期间发表的学术论文  86-87

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物遗传学
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