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成骨相关转录因子Osterix对成骨细胞分化能力调控作用的研究

作　者: 陈琼玉
导　师: 洪岸
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: 间充质干细胞 成骨分化 转录因子 Osx
分类号: Q254
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


目的：探索小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，MSC)体外分离培养及诱导成骨分化。分析细胞向成骨方向分化过程中相关转录因子Osx的表达情况。并进一步深入研究Osx对成骨早期标记基因Ⅰ型胶(alphal Type Ⅰ Collagen，COLLa1)表达的调控机制。 方法：本实验联合应用密度梯度离心和贴壁筛选的方法从小鼠骨髓中分离出间充质干细胞，采用MTT比色法检测不同接种密度、不同浓度的胎牛血清对MSC生长的影响，用骨形成蛋白BMP2诱导MSC向成骨方向分化。通过RT-PCR和巢式PCR方法从小鼠成肌干细胞C2C12中扩增出Osx全长基因序列，并通过分子克隆手段将Osx装入质粒pCDNA3.1。用脂质体转染的方法将Osx基因转入细胞，分别采用生物化学、组织化学法检测成骨分化指标碱性磷酸酶ALP的表达，用RT-PCR方法检测Osx的表达。最后用电泳迁移试验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)检测Osx对成骨分化早期标记基因COLLa1的调节机制。 结果：以5x10~3个／cm~2的密度接种、加入10％胎牛血清有利于MSC增殖，以8μg／ml自制BMP2诱导MSC，于诱导后第六天能检测到较高的ALP活性，促使MSC向成骨方向分化。Osx转入MSC后，用G418能筛选出稳定表达的克隆，同时能检测到成骨分化的指标。EMSA结果显示Osx与成骨早期标记基因COLLa1启动子发生了特异性结合。 结论：成功分离出MSC，并初步优化了MSC体外培养条件，利用BMP2成功诱导MSC向成骨方向分化，证实了成骨转录因子Osx成骨分化过程中的调控作用，为进一步深入探讨成骨分化过程中的其它调控机制提供的方法学上的基础。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-9
缩略词  9-10
第一章 前言  10-25
  1.1 骨的发生  10-12
    1.1.1 膜性骨发生  10
    1.1.2 软骨性骨发生  10-12
  1.2 成骨细胞骨形成机制研究  12-17
    1.2.1 成骨细胞的起源  12
    1.2.2 成骨细胞发展阶段  12-13
    1.2.3 成骨细胞骨形成的调控机制  13-17
  1.3 成骨细胞分化相关转录因子及其调控机制  17-21
    1.3.1 转录因子 Runx2  17-19
    1.3.2 转录因子 Osx  19-20
    1.3.3 转录因子 Msx1/2  20
    1.3.4 转录因子 DLX5/6  20-21
  1.4 成骨细胞表型分化  21-22
    1.4.1 I型胶原  21
    1.4.2 碱性磷酸酶  21-22
    1.4.3 骨桥蛋白  22
    1.4.4 骨钙蛋白  22
  1.5 间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)  22-24
    1.5.1 MSC的生物学特性  22-23
    1.5.2 MSC的分离培养  23-24
    1.5.3 MSC的定向诱导分化  24
  1.6 本研究的目的和意义  24-25
第二章 实验材料与试剂  25-31
  2.1 主要实验材料  25-26
  2.2 主要实验仪器  26-27
  2.3 常用试剂及其配制  27-31
第三章 间充质干细胞(MSC)体外分离培养及成骨诱导  31-44
  3.1 实验方法  31-37
    3.1.1 MSC体外分离培养相关实验  31-33
      3.1.1.1 MSC分离纯化  31
      3.1.1.2 稀释铺板法获取 MSC单细胞克隆  31-32
      3.1.1.3 MSC传代  32
      3.1.1.4 MSC冻存  32
      3.1.1.5 MSC复苏  32
      3.1.1.6 MTT比色法测定不同浓度胎牛血清对 MSC生长的影响  32-33
      3.1.1.7 MTT比色法测定不同细胞接种密度对 MSC生长的影响  33
      3.1.1.8 测定 MSC的生长曲线  33
    3.1.2 BMP2诱导MSC成骨分化相关实验  33-37
      3.1.2.1 BMP2诱导 MSC成骨分化最佳浓度摸索  33-34
      3.1.2.2 BMP2诱导成骨分化过程中，ALP表达的动力学分析  34
      3.1.2.3 RNA抽提  34
      3.1.2.4 用 DNase I(RNase free)处理 RNA，去除基因组 DNA  34-35
      3.1.2.5 逆转录 PCR  35
      3.1.2.6 常规 PCR  35-36
      3.1.2.7 钙钻法染色  36
      3.1.2.8 茜素红染色  36-37
      3.1.2.9 统计分析  37
  3.2 实验结果与分析  37-42
    3.2.1 MSC体外分离培养相关实验  37-40
      3.2.1.1 细胞形态观察  37
      3.2.1.2 MSC单细胞克隆的获取  37-38
      3.2.1.3 不同血清浓度对 MSC生长的影响  38
      3.2.1.4 不同细胞接种密度对 MSC生长的影响  38-39
      3.2.1.5 MSC生长曲线  39-40
    3.2.2 BMP2诱导 MSC成骨分化相关实验  40-42
      3.2.2.1 BMP2诱导 MSC成骨分化最佳浓度摸索  40
      3.2.2.2 BMP2诱导 MSC成骨分化过程中ALP表达的动力学变化  40-41
      3.2.2.3 BMP2诱导 MSC成骨分化的生物学指标  41
      3.2.2.4 BMP2诱导 MSC成骨分化的组织化学指标  41-42
  3.3 讨论  42-44
    3.3.1 MSC的分离、纯化  42-43
    3.3.2 MSC的扩增、培养  43
    3.3.3 MSC的成骨分化  43-44
第四章 转录因子Osx对成骨细胞分化作用的研究  44-57
  4.1 实验方法  44-48
    4.1.1 pCDNA3.1-Osx真核表达载体的构建  44-47
      4.1.1.1 巢式 PCR扩增Osx基因  44-45
      4.1.1.2 DNA(质粒载体与目的基因)双酶切  45
      4.1.1.3 DNA体外连接  45-46
      4.1.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  46
      4.1.1.5 转化  46
      4.1.1.6 重组子的鉴定  46-47
    4.1.2 pCDNA3.1-Osx在细胞中过表达  47-48
      4.1.2.1 阳离子脂质体转染条件的优化  47
      4.1.2.2 质粒pCDNA3.1-Osx转染细胞  47-48
      4.1.2.3 钙钻法染色检测 ALP表达  48
      4.1.2.4 茜素红染色检测OC表达  48
      4.1.2.5 逆转录 PCR签定Osx的表达  48
      4.1.2.6 流式细胞仪测定细胞周期  48
  4.2 结果与分析  48-55
    4.2.1 pCDNA3.1-Osx真核表达载体的构建  48-49
    4.2.2 pCDNA3.1-Osx在细胞中表达  49-55
      4.2.2.1 阳离子脂质体转染条件的优化  49-50
      4.2.2.2 质粒pCDNA3.1-Osx转染细胞相关实验  50-55
  4.3 讨论  55-57
第五章 Osx促进collagen 1a表达及其分子机制研究  57-71
  5.1 实验方法  57-64
    5.1.1 逆转录 PCR检测 COLLa1的表达  57
    5.1.2 核抽提物的制备  57-58
    5.1.3 单链 DNA探针杂交形成双链 DNA探针  58
    5.1.4 检测整个 EMSA反应系统  58-60
    5.1.5 EMSA检测经 BMP2诱导后 MSC中Osx与 COLLa1启动子相互作用  60-61
    5.1.6 EMSA检测 Osx过表达后与 COLLa1启动子相互作用  61-62
    5.1.7 确定Osx在 COLLa1启动子上的核心结合部位  62-64
  5.2 实验结果与分析  64-70
    5.2.1 逆转录 PCR检测 COLLa1的表达  64
    5.2.2 生物信息的方法对小鼠COLLa1启动子区域的搜索  64-67
    5.2.3 检测整个 EMSA反应系统  67
    5.2.4 EMSA检测经 BMP2诱导后 MSC中Osx与 COLLa1启动子相互作用  67-68
    5.2.5 EMSA检测 Osx过表达后与 COLLa1启动子相互作用  68-69
    5.2.6 确定Osx在 COLLa1启动子上的核心结合部位  69-70
  5.3 讨论  70-71
第六章 结论与展望  71-72
  6.1 结论  71
  6.2 展望  71-72
参考文献  72-79
附录  79-83
致谢  83

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生理学 > 细胞分化
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