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兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立

作　者: 赵建军
导　师: 张兆旺
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 兔早期胚胎性别鉴定 SRY基因多重PCR 巢式PCR 非电泳序列同源性
分类号: S829.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 97次
引　用: 3次
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内容摘要

本试验根据兔 SRY基因序列设计两对引物作为兔雄性特异性引物;根据兔APP基因序列设计3对常染色体引物作为内标引物。根据这些引物组合建立了兔早期胚胎性别鉴定的双重和巢式PCR反应体系。针对所建立的双重和巢式PCR体系进行了不同扩增条件的筛选和优化,并对巢式PCR结果进行了电泳法和非电泳法检测的比较。同时将兔SRY基因序列分别与人、牛、绵羊和小鼠SRY基因进行了同源性比较,并用本试验中所采用的SRY巢式引物分别对人、牛、绵羊和小鼠基因组DNA及冲卵液进行扩增,检测分析引物的特异性和分析胚胎性别鉴定过程中可能存在的污染因素。用24只公兔、9只母兔的血液和肝脏组织基因组DNA样品进行多重和巢式PCR扩增。结果表明,多重PCR扩增公兔基因组,可以扩增出282bp的SRY基因片断和173bp的APP基因片断,母兔只能扩增出173bp的APP基因片断,扩增灵敏度为100pg;巢式PCR两轮扩增后均进行电泳法和非电泳法检测扩增产物,结果表明公兔基因组DNA扩增出282bp的SRY基因片段(电泳法),在紫外分析仪下管内有明亮的荧光(非电泳法),母兔没有扩增产物也无荧光,扩增灵敏度为10pg。多重PCR扩增灵敏度明显低于巢式PCR扩增。但两种PCR扩增性别鉴定结果均与实际性别完全一致,准确率为100%。对12只母兔分别用进口FSH+hCG(8只)和PMSG+hCG(4只)进行超数排卵处理,FSH+hCG组(排卵点72.4±13.6,胚胎52.6±14.4)比PMSG+hCG组(排卵点32±6,胚胎21.8±4.2)获得了更好的超排效果(P<0.01)。将部分胚胎移植给4只同期化处理的母兔,怀孕2只,其中一只妊娠20天流产,另一只顺利产下8只小兔。部分超排胚胎用BIO-RAID显微操作仪和徒手切割法比较,结果表明,兔早期胚胎采用徒手切割法更灵活、简便,易于在生产现场进行操作,但此方法要达到精确控制取样细胞数量需要反复练习操作技巧。用本试验建立的PCR反应体系,对46枚超排胚胎性别鉴定结果表明,多重PCR只能对32细胞及以上胚胎细胞获得准确鉴定,不能作为兔胚胎PCR性别鉴定的应用;巢式PCR可以对8分胚(约4细胞)进行准确鉴定(同一胚胎扩增符合率100%),而且电泳法与非电泳法检测结果一致。兔SRY基因序列与其他几种哺乳动物(人、牛、绵羊、小鼠)同源性分析结果表明,兔SRY基因序列与牛、绵羊和小鼠SRY基因序列同源性在80%~82%之间,与人的为87%,且在本试验所设计的SRY基因引物,只对兔雄性特异,其他动物(人、牛、绵羊、小鼠)雄性DNA及冲卵液均不影响鉴定结果。本论文中建立的巢式PCR性别鉴定体系可以在实际生产中推广应用。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-10
第一章哺乳动物性别控制方法与研究进展  10-22
  1、前言  10
  2、哺乳动物性别控制研究进展  10-14
    2.1 Ｘ精子与Ｙ精子的分离  10-11
    2.2 早期胚胎的性别鉴定方法  11-14
  3 哺乳动物早期胚胎PCR 法性别鉴定研究进展  14-22
    3.1 胚胎性别决定与SRY 基因  14-16
    3.2 用于PCR 性别鉴定的Y 染色体基因  16-17
    3.3 早期胚胎PCR 性别鉴定法的发展历史  17
    3.4 PCR 性别鉴定技术体系的改进  17-20
    3.5 PCR 鉴定法的优缺点  20-21
    3.6 兔胚胎PCR 性别鉴定研究现状  21-22
第二章兔超数排卵与胚胎移植试验  22-27
  1 材料与方法  22-24
    1.1 试验材料  22
    1.2 试验方法  22-24
  2 结果与分析  24-25
    2.1 供体超数排卵结果  24
    2.2 胚胎移植受胎率与产仔数  24-25
  3 讨论  25-26
    3.1 不同激素超排处理效果  25
    3.2 两种激素组合超排处理后72h 胚胎所处的位置  25
    3.3 胚胎移植效果  25-26
  4 小结  26-27
第三章兔早期胚胎PCR 性别鉴定体系的建立  27-52
  试验一兔早期胚胎多重PCR 扩增性别鉴定体系的建立  27-43
    1 材料与方法  27-35
      1.1 试验材料  27-29
      1.2 试验方法  29-35
    2 结果与分析  35-41
      2.1 基因组提取结果  35
      2.2 引物筛选结果  35-37
      2.3 兔早期胚胎性别鉴定多重PCR 反应体系的优化  37-39
      2.4 兔早期胚胎活体采样  39
      2.5 兔早期胚胎性别鉴定多重PCR 反应体系的应用  39-41
    3 讨论  41-42
      3.1 兔胚胎活体采样方法  41
      3.2 多重PCR 胚胎性别鉴定灵敏度分析  41-42
    4 小结  42-43
  试验二 SRY 基因的巢式PCR 扩增  43-52
    1 材料与方法  43-45
      1.1 试验材料  43
      1.2 试验方法  43-45
    2 结果与分析  45-49
      2.1 PCR 扩增体系优化结果  45-47
      2.2 PCR 扩增体系应用  47-49
    3 讨论  49-51
      3.1 巢式PCR 性别鉴定灵敏度  49-50
      3.2 非电泳法检测PCR 扩增产物  50-51
    4 小结  51-52
第四章PCR 性别鉴定可能的污染因素及与SRY 序列同源性分析  52-55
  1 材料与方法  52
    1.1 试验材料  52
    1.2 试验方法  52
  2 结果与分析  52-53
    2.1 PCR 扩增结果  52-53
    2.2 兔SRY 基因序列与其他哺乳动物SRY 序列比对  53
  3 讨论  53-54
  4 小结  54-55
第五章结论与创新点  55-56
  1 结论  55
  2 创新点  55-56
附图  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-64
个人简介  64-65
导师简介  65-66

兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立

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