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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的修饰及其免疫原性的研究

作　者: 马艳
导　师: 方六荣
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因非中和表位A 中和表位B PADRE表位突变体单克隆抗体免疫反应
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的新发病毒性传染病，主要导致妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪的大量死亡。该病自从1987年在美国首次报道以来，现已遍及世界各主要养猪国家，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。由ORF5基因编码的GP5蛋白是PRRSV最主要的结构蛋白和免疫原性蛋白之一，并能诱发最强的中和抗体，是研制PRRS新型疫苗的良好靶蛋白。但以天然ORF5基因构建的多种新型疫苗均难以诱发较早和较高水平的抗体，特别是保护性的中和抗体。分析其原因可能是位于GP5蛋白中和表位B(S³⁷H³⁸（L/I）³⁹Q⁴⁰（L/S）⁴¹I⁴²Y⁴³N⁴⁴L⁴⁵)之前的非中和表位A(（A／V）²⁷L²⁸V²⁹N³⁰)对中和表位产生了覆盖效应，导致中和表位不能充分暴露，从而不能有效诱发较高的中和抗体。鉴于此，本研究以PRRSV GP5蛋白为研究对象，首先在大肠杆菌中表达了ORF5基因不同区域缺失的突变体，建立了相应的ELISA诊断方法，并获得了1株针对GP5胞内区的单克隆抗体。在此基础上，针对表位A和表位B构建了一系列不同组合的ORF5基因突变体，探讨了这些突变体的免疫原性。具体研究内容如下： 1．ORF5基因不同区域缺失突变体的构建及其在大肠杆菌中的表达通过PCR方法构建了ORF5基因不同区域缺失的4种突变体，即ORF542（截去N端信号肽，编码26-200aa）、ORF552（截去N端信号肽和表位A，编码33-200aa）、ORF546（仅含表位A和表位B，编码26-66aa）和ORF556（仅含表位B，编码33-66aa）。将上述4种突变体分别插入原核表达载体pGEX-KG中，获得了4种原核表达质粒pKG-542、pKG-552、pKG-546和pKG-556。转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下，4种表达质粒均获得高效表达，表达的融合蛋白分子量分别为42kDa（GST-542）、41kDa（GST-552）、30kDa（GST-546）、29kDa（GST-556），并且均以包涵体形式存在。Western blot检测进一步证实表达产物均具有良好的反应原性。 2．单克隆抗体（McAb）的制备将大肠杆菌表达的重组融合蛋白GST-552纯化后作为免疫原免疫Balb／c小鼠，建立了1株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株并且命名为52-C。分别利用表达的重组融合蛋白GST-542、GST-552、GST-546和GST-556进行间接ELISA和Westernblot分析，发现McAb 52-C能与GST-542和GST-552发生较强反应，而不与GST-546和GST-556发生反应，表明所获得的McAb 52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区。利用不同的抗鼠免疫球蛋白亚型抗体鉴定显示单抗52-C为IgG2a亚型。特异性试验证实，52-C不与伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（HCV）和猪口蹄疫病毒（FMDV）发生反应。中和试验检测发现McAb 52-C无中和活性。

全文目录

目录  3-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表(Abbreviation)  11-13
第1章文献综述  13-32
  1.1 PRRSV分类  13-14
  1.2 理化特性  14
  1.3 抗原性  14
  1.4 PRRSV分子生物学研究进展  14-25
    1.4.1 PRRSV基因组的结构与功能  14-16
    1.4.2 PRRSV的蛋白质  16-21
      1.4.2.1 聚合酶  17
      1.4.2.2 主要结构蛋白  17-20
      1.4.2.3 次要结构蛋白  20-21
    1.4.3 PRRSV的基因组变异和RNA重组  21-22
    1.4.4 PRRSV的抗原性变异  22-23
    1.4.5 PRRSV的毒力变异  23
    1.4.6 PRRSV的单克隆抗体  23-25
      1.4.6.1 抗GP3、GP4和GP5的McAb  23-24
      1.4.6.2 抗M蛋白McAb  24
      1.4.6.3 抗N蛋白McAb  24-25
  1.5 PRRSV的免疫学反应  25-29
    1.5.1 抗PRRSV的体液免疫反应  25-27
    1.5.2 PRRSV的细胞免疫反应  27-28
    1.5.3 PRRSV与免疫抑制  28-29
  1.6 PRRS疫苗研究进展  29-32
    1.6.1 PRRS传统常规疫苗  29-30
      1.6.1.1 PRRS灭活疫苗  29
      1.6.1.2 PRRS弱毒疫苗  29-30
    1.6.2 PRRS新型疫苗研究进展  30-32
      1.6.2.1 亚单位疫苗  30
      1.6.2.2 病毒载体疫苗  30-31
      1.6.2.3 DNA疫苗  31-32
第2章 GP5蛋白免疫增强突变体的研究及其单克隆抗体的制备  32-78
  2.1 研究的目的与意义  32-33
  2.2 实验材料与方法  33-40
    2.2.1 细胞、菌株、动物  33
    2.2.2 质粒、载体  33-35
    2.2.3 本研究中所用的寡核苷酸引物  35-36
    2.2.4 工具酶及主要试剂  36
    2.2.5 免疫反应试验所用抗原及血清  36
    2.2.6 培养基及主要试剂的配制  36-37
    2.2.7 缓冲液与相关试剂及其配制  37-40
      2.2.7.1 质粒提取用缓冲液及鉴定试剂  37-38
      2.2.7.2 感受态细胞制备用试剂  38
      2.2.7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液及试剂  38-39
      2.2.7.4 Western blot缓冲液及试剂  39
      2.2.7.5 ELISA缓冲液及试剂  39-40
      2.2.7.6 其它缓冲液及试剂  40
  2.3 试验方法  40-55
    2.3.1 目的外源基因的PCR扩增  40
    2.3.2 限制性内切酶酶切反应  40
    2.3.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测  40-41
    2.3.4 线性质粒DNA末端去磷酸化  41
    2.3.5 PCR产物或酶切产物的回收与纯化  41
    2.3.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应  41-42
    2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  42
    2.3.8 连接产物的转化  42
    2.3.9 质粒的小量制备(碱裂解法)  42-43
    2.3.10 质粒的大量制备(碱裂解法)  43-44
    2.3.11 质粒DNA的定量  44
    2.3.12 质粒重组质粒(阳性质粒)的鉴定  44
    2.3.13 质粒转染(脂质体介导转染法)  44-45
    2.3.14 诱导表达  45
    2.3.15 用于SDS-PAGE电泳的包涵体提取  45
    2.3.16 用于ELISA抗原的包涵体提取  45
    2.3.17 GP5-ELISA方法的建立  45-46
      2.3.17.1 GP5-ELISA最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定(方阵滴定)  45-46
      2.3.17.2 GP5-ELISA阴阳性界限的确定  46
    2.3.18 Western blot检测目的蛋白的体外表达  46-47
    2.3.19 间接ELISA试验  47-48
    2.3.20 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)  48-52
      2.3.21.1 单克隆抗体制备的技术路线  48-49
      2.3.21.2 抗原的制备  49
      2.3.21.3 动物免疫  49
      2.3.21.4 SP2／O骨髓瘤细胞的活化  49
      2.3.21.5 SP2／O骨髓瘤细胞的制备  49-50
      2.3.21.6 免疫脾细胞的制备  50
      2.3.21.7 饲养细胞的制备  50
      2.3.21.8 细胞融合  50-51
      2.3.21.9 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清  51
      2.3.21.10 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)  51
      2.3.21.11 杂交瘤细胞染色体数的检测  51-52
      2.3.21.12 单克隆抗体的生产和效价测定  52
      2.3.21.13 单克隆抗体亚类鉴定  52
      2.3.21.14 单克隆抗体的结合活性及特异性鉴定  52
      2.3.21.15 单克隆抗体中和活性鉴定  52
      2.3.21.16 单克隆抗体识别表位分析  52
    2.3.22 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定  52-53
    2.3.23 动物试验  53
    2.3.24 免疫小鼠待检血清的制备与处理  53
    2.3.25 细胞免疫的检测  53-54
    2.3.26 统计学方法  54-55
  2.4 结果与分析  55-72
    2.4.1 ORF5基因突变体的构建一  55
    2.4.2 原核表达质粒的构建与鉴定  55-58
    2.4.3 重组原核融合蛋白在大肠杆菌中的融合表达  58-59
    2.4.4 Western blot检测目的融合蛋白的体外表达  59
    2.4.5 GP5-ELISA最佳条件的确定  59
    2.4.6 GP5-ELISA阴阳界限的确定  59-60
    2.4.7 单克隆抗体的制备  60-63
      2.4.7.1 抗原的制备  60
      2.4.7.2 细胞融合  60
      2.4.7.3 杂交瘤细胞的筛选  60
      2.4.7.4 单克隆抗体的生产和效价测定  60-61
      2.4.7.5 杂交瘤细胞染色体数的检测  61-62
      2.4.7.6 单克隆抗体亚类鉴定  62
      2.4.7.7 单克隆抗体的特异性鉴定  62
      2.4.7.8 单克隆抗体中和活性鉴定  62
      2.4.7.9 单克隆抗体识别表位鉴定  62-63
    2.4.8 ORF5基因突变体的构建二  63-64
    2.4.9 真核表达质粒的构建与鉴定  64-68
    2.4.10 Western blot鉴定目的基因体外表达活性  68-69
    2.4.11 动物试验  69
    2.4.12 ELISA抗体检测  69-70
    2.4.13 细胞免疫反应检测  70-71
    2.4.14 中和抗体水平检测  71-72
  2.5 讨论  72-77
    2.5.1 ORF5基因突变体的构建  72-73
    2.5.2 ELASA检测方法的建立  73
    2.5.3 单克隆抗体的制备  73-75
    2.5.4 修饰的免疫增强突变体的免疫  75-77
  2.6 结论  77-78
参考文献  78-86
致谢  86-87
附录  87

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的修饰及其免疫原性的研究

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