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大鼠TSHα cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

作　者: 陈猛
导　师: 张镜宇；梁东春；孙蓓；左爱军
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 促甲状腺激素融合表达 RT-PCR 巢式PCR 促甲状腺激素受体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 59次
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内容摘要

作为自体免疫性疾病未经治疗的Graves’病患者血中存在的TRAb,与TSH一样也能与TSHR结合,并产生一系列生物学效应,是引起Graves’病主要和直接的原因。为了研究TRAb的来源,因此需制备TSH抗体以进行后续实验。TSH由α和β两条链组成。β链的顺序与促黄体激素、促卵泡激素,绒毛膜促性腺激素的β链完全不同,因此TSH的特异性功能主要体现在β链。α链的氨基酸顺序与以上三种激素的α链相似,被认为是上述激素所共有。为了制备TSH抗体,有必要先获得大鼠TSHα以免疫动物。在实验研究中,多选用大鼠制作甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退的动物模型。通过检测血清中甲状腺激素和TSH的含量证实动物模型的建立是否成功。目前检测大鼠血清中TSH含量的方法,多采用人促甲状腺激素(TSH)定量检测试剂盒。因此,获得一定量的大鼠TSH进而开发大鼠TSH的定量检测试剂盒很有应用价值。本研究我们提取大鼠垂体组织的总RNA为模板,采用RT-PCR和巢式PCR的方法克隆大鼠TSHα链编码基因的外显子序列,克隆入pGEM-T Easy载体。测序证实序列正确后,将目的基因插入融合型原核表达载体pGEX-3X后,转化入E.coli DH5α[pREP4],进行融合表达。SDS-PAGE电泳查看表达产物大小和表达量,Western-blotting进一步鉴定。将重组质粒pGEX-3X/TSHα优化表达条件进行大量表达,TSHα的表达量达到6mg/L培养基。重组蛋白TSHα占菌体蛋白的24.32%。目的蛋白含GST纯化标签,可以经亲和层析吸附于GST层析柱,冲洗除去非特异吸附的杂蛋白后,将目的蛋白洗脱,利用蛋白纯化层析柱对大量表达产物进行蛋白纯化。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-8
符号说明  8-10
前言  10-14
  研究现状、成果  10-13
  研究目的、方法  13-14
1 对象和方法  14-33
2 结果  33-40
3 讨论  40-46
4 小结  46-47
结论  47-48
参考文献  48-52
发表论文和参加科研情况说明  52-53
附录  53-55
综述  55-63
  促甲状腺激素检测方法的进展  55-61
  综述参考文献  61-63
致谢  63-64

大鼠TSHα cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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