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副溶血弧菌VPL4-90活的非可培养状态的初步研究

作　者: 孙作俤
导　师: 胡忠
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 副溶血弧菌 活的非可培养状态 高温 复苏 EMA-PCR
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 29次
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内容摘要


徐怀恕等在1982年第一次提出了细菌“活的非可培养状态(viable but nonculturable state,VBNC)”的概念,此后越来越多的报告阐明了细菌这种状态的存在。所谓细菌的VBNC状态是指长期处于不良环境条件下的细菌,用常规的固体平板培养方法不能培养出来,但仍然具有代谢活性的一种特殊生理状态。处于该状态的致病菌,在一定条件下可以复苏,并具有潜在的致病性。VBNC状态作为微生物学的一个全新概念,受到了极大的关注,它不仅对食品安全问题产生了新的考虑,而且对菌种保藏、活细菌的定义等都提出了新的探讨。副溶血弧菌是一种嗜盐的革兰氏阴性细菌,是大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。本文选用副溶血弧菌VP L4-90作为研究VBNC状态的对象,探讨了其进入VBNC状态的条件,并进一步研究了VBNC状态副溶血弧菌的复苏现象及条件;建立了一种新型的基于PCR的活菌检测方法,并将此方法运用于高温诱导的VBNC状态副溶血弧菌的检测中。1.以常规的低温贫营养方法诱导副溶血弧菌进入VBNC状态,分别用AODC、DVC和PC等细菌检测方法对诱导过程进行检测,验证了副溶血弧菌能够进入VBNC状态;并对进入VBNC状态的副溶血弧菌的形态、遗传物质等进行了初步研究。2.进一步对副溶血弧菌进入VBNC状态的条件(温度、细菌的生长状况和培养密度)进行了优化。结果发现稳定期的副溶血弧菌VP L4-90在低温贫营养条件下,较短的时间内可以进入VBNC状态;高温下贫营养条件也能在短时间内诱导副溶血弧菌进入VBNC状态;培养密度只对副溶血弧菌VP L4-90进入VBNC状态的时间上有所影响。3.在VBNC状态细菌复苏的研究方面,利用最大或然法定量样品中可以复苏的细菌数的结果说明,只有非常少数的VBNC状态细菌具有复苏的能力。复苏后,少量的活菌可以利用死菌的营养进行快速的生长。4.本文利用EMA染料处理与Real Time PCR相结合,建立了一种新型的基于PCR的活菌检测方法——EMA-PCR。5.通过研究,发现在46℃副溶血弧菌一样也可以进入VBNC状态。进一步将EMA-PCR方法运用于高温诱导的实验中。虽然在高温的培养过程中细菌出现了大量的死菌,但是其中也有小部分活的VBNC状态存在,本实验结果给食品安全和细菌检测提供了一个重要的参考。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
缩略语  7-12
前言  12-21
  1. 细菌VBNC 状态的生物特性  13-14
  2. VBNC 状态的诱导因素  14-15
    2.1 温度  14
    2.2 盐度或渗透压  14
    2.3 营养水平  14
    2.4 光照  14-15
    2.5 生物因素  15
  3. VBNC 细菌的检测技术  15-17
    3.1 活菌直接计数法(DVC)  15-16
    3.2 基于氧化还原能力  16
    3.3 基于细胞质膜结构完整性的检测  16
    3.4 生物发光  16-17
    3.5 免疫学方法  17
    3.6 EMA-PCR  17
  4. VBNC 状态细菌的复苏  17-18
  5. VBNC 状态细菌的致病性  18-19
  6. VBNC 状态形成的原因  19
  7. 本论文的主要研究内容及意义  19-21
第一章 副溶血弧菌VBNC 状态的诱导及其特征  21-35
  1. 材料与方法  21-25
    1.1 菌株  21
    1.2 主要试剂  21-22
    1.3 培养基  22
    1.4 菌株的菌落形态  22
    1.5 菌株VP L4-90 的生长曲线  22
    1.6 菌株致病基因的携带情况  22
    1.7 菌株的培养和VBNC 状态的诱导  22-23
    1.8 不同温度对副溶血弧菌VP L4-90 在人工海水中生长的影响  23
    1.9 不同细菌的生长状况对其在低温人工海水中的生长的影响  23
    1.10 细菌密度对在低温人工海水中的副溶血弧菌VP L4-90 生长的影响  23
    1.11 细菌数测定  23-24
      1.11.1 总菌数测定  23-24
      1.11.2 活菌数测定  24
      1.11.3 可培养数测定  24
    1.12 VBNC 状态副溶血弧菌的扫描电镜观察  24
    1.13 流式细胞仪检测细胞内核酸的密度  24-25
  2. 结果与分析  25-32
    2.1 副溶血弧菌VP L4-90 菌株的特征  25-26
      2.1.1 副溶血弧菌在TCBS 固体培养基上的菌落形态  25
      2.1.2 菌株VP L4-90 在肉汤培养基中的生长状况  25-26
      2.1.3 副溶血弧菌VP L4-90 的致病基因  26
    2.2 副溶血弧菌VP L4-90 进入VBNC 状态的影响因素  26-30
      2.2.1 温度对副溶血弧菌VP L4-90 进入VBNC 状态的影响  26-27
      2.2.2 细菌的生长状况  27-29
      2.2.3 细菌密度  29-30
    2.3 VBNC 状态的副溶血弧菌的特征  30-32
      2.3.1 扫描电镜下副溶血弧菌的形态特征  30
      2.3.2 VBNC 状态与正常状态核酸密度的差异  30-31
      2.3.3 AODC 及DVC 检测方法在荧光显微镜的效果  31-32
  3 讨论  32-35
    3.1 副溶血弧菌VP L4-90 菌株的特征  32
    3.2 副溶血弧菌VBNC 状态的诱导及该状态的一些特征  32-33
    3.3 进入VBNC 状态的影响因素  33-35
      3.3.1 温度  33
      3.3.2 细菌的生长状况  33-34
      3.3.3 细菌密度  34-35
第二章 VBNC 状态副溶血弧菌复苏的初步研究  35-42
  1. 材料和方法  35-36
    1.1 菌株  35
    1.2 复苏的条件  35-36
    1.3 复苏过程中细菌总数的检测  36
    1.4 在高浓度的死菌存在时活菌的生长速度  36
    1.5 死菌的获得  36
  2. 结果  36-40
    2.1 在常温下VBNC 状态副溶血弧菌的复苏  36-37
    2.2 利用最大或然法定量VBNC 状态的样品中可复苏的细菌数量  37-38
    2.3 复活过程中细菌总数的变化  38-39
    2.4 活菌可以利用死菌的营养快速生长  39
    2.5 冻溶过程中活细菌数的变化  39-40
    2.6 实时检测VBNC 状态的副溶血弧菌的复苏情况  40
  3. 讨论  40-42
第三章 一种基于PCR 反应的活菌检测方法——EMA-PCR  42-51
  1. 材料和方法  42-45
    1.1 菌株和培养条件  42
    1.2 细菌DNA 提取  42-43
    1.3 EMA 与DNA 共价链接  43
    1.4 流式细胞仪检测EMA 发射的荧光  43
    1.5 普通PCR 反应条件  43
    1.6 荧光PCR 反应条件  43-44
    1.7 引物特异性实验  44
    1.8 细菌DNA 作为模板的PCR 实验  44
    1.9 菌落PCR  44
    1.10 EMA 对细菌DNA 作为模板的PCR 反应的影响  44
    1.11 EMA 对死菌作为模板的PCR 反应的影响  44
    1.12 EMA 对活菌的影响  44-45
  2. 结果  45-50
    2.1 引物的灵敏性及特异性  45-46
      2.1.1 引物的灵敏性  45-46
      2.1.2 引物特异性  46
    2.2 流式细胞仪检测EMA 发射荧光  46-47
    2.3 EMA-PCR  47-50
      2.3.1 EMA 染料对以DNA 作为模板的PCR 反应的影响  47
      2.3.2 EMA 对以死菌作为模板的PCR 反应的影响  47-48
      2.3.3 EMA 对以活菌作为模板的普通PCR 反应的影响  48-49
      2.3.4 EMA 对以活菌作为模板的荧光PCR 反应的影响  49-50
  3 讨论  50-51
第四章 高温诱导副溶血弧菌VBNC 状态及其验证  51-57
  1. 材料和方法  51-52
    1.1 菌株及其培养方法  51
    1.2 高温诱导  51
    1.3 利用EMA-RT-PCR 检测高温诱导的样品  51-52
    1.4 扫描电镜观察高温诱导的副溶血弧菌形态  52
    1.5 流式细胞仪检测细胞内核酸的密度  52
    1.6 室温复苏  52
  2. 结果  52-55
    2.1 VBNC 状态的确定  52-53
    2.2 扫描电镜下副溶血弧菌的形态特征  53-54
    2.3 高温诱导与正常状态副溶血弧菌核酸密度的差异  54-55
    2.4 室温复苏的效果  55
  3 讨论  55-57
总结与展望  57-59
  1. 总结  57-58
  2. 展望与研究设想  58-59
参考文献  59-64
致谢  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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