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甜菜夜蛾对昆虫生长调节剂敏感性测定及蜕皮激素受体cDNA克隆

作　者: 徐蓬军
导　师: 刘永杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 甜菜夜蛾昆虫生长调节剂敏感性蜕皮激素受体超气门蛋白基因克隆
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)属鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性分布的多食性重要农业害虫，主要危害蔬菜、棉花和观赏性植物等。由于一直依靠化学防治，甜菜夜蛾已对多种类型农药产生抗性。昆虫生长调节剂如虫酰肼和几丁质合成抑制剂类杀虫剂是近年来防治甜菜夜蛾的主要替代农药。这类杀虫剂对鳞翅目害虫都表现了高度的选择性，对哺乳动物、鸟、鱼类、其它脊椎动物和各种天敌无毒害作用，是害虫综合防治的重要优选药剂。害虫对药剂都存在产生抗药性的风险，为了更有效地控制甜菜夜蛾的危害，掌握甜菜夜蛾对该类杀虫剂的敏感性变化十分重要。昆虫的蜕皮和变态受蜕皮激素和保幼激素的严格控制。蜕皮激素通过与蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)形成的异源二聚体相互作用，起动包括转录因子表达在内的级联反应，从而引起昆虫的蜕皮和变态。虫酰肼是一种新合成的非甾醇蜕皮激素类杀虫剂，跟蜕皮激素一样作用于蜕皮激素受体，引起昆虫早熟、致死性蜕皮；几丁质抑制剂类杀虫剂则阻止几丁质的正常合成和转运，从而杀死昆虫，两者的作用机理完全不同。多种昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的成功克隆为建立基于昆虫蜕皮激素受体的高通量筛选技术奠定了基础，并且可以通过多种途径实现。在细菌、酵母、昆虫细胞系等中表达的EcR和USP蛋白，无论其粗提液，还是纯化蛋白，均可用于活性筛选。本研究克隆甜菜夜蛾EcR和USP基因的目的就是为建立活性筛选技术作准备。本文研究内容包括两部分：甜菜夜蛾田间种群对昆虫生长调节剂类杀虫剂的敏感性测定和甜菜夜蛾蜕皮激素受体和超气门蛋白基因cDNA片段的克隆。研究结果如下：

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章前言  12-28
  1 甜菜夜蛾发生与防治  12-16
    1.1 甜菜夜蛾的发生为害  12-14
    1.2 甜菜夜蛾的抗药性与防治  14-16
  2 昆虫蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)  16-28
    2.1 昆虫蜕皮激素和保幼激素  17-18
    2.2 昆虫EcR的结构与功能  18-19
    2.3 蜕皮激素与EcR的作用机理  19-20
    2.4 具有蜕皮激素活性杀虫剂的研究进展  20-25
      2.4.1 酰基肼类化合物  21-22
      2.4.2 作用机制  22-24
      2.4.3 新药剂活性筛选  24-25
    2.5 研究昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白的意义  25-28
      2.5.1 指导先导化合物分子设计  25
      2.5.2 建立基于EcR的新化合物杀虫活性筛选技术  25-26
      2.5.3 开发基因调控开关  26-28
第二章甜菜夜蛾对昆虫生长调节剂类杀虫剂的敏感性测定  28-33
  1 材料与方法  28-29
    1.1 供试甜菜夜蛾  28-29
    1.2 供试药剂  29
    1.3 测定方法  29
  2 结果与分析  29-31
  3 讨论  31-33
第三章甜菜夜蛾总RNA的提取  33-41
  1 材料与仪器设备  33-34
    1.1 实验材料  33
    1.2 试剂及仪器设备  33-34
  2 实验方法  34-37
    2.1 实验预准备  34
    2.2 总RNA的提取  34-37
      2.2.1 酸性酚／氯仿／异戊醇  34-36
      2.2.2 TRNzol法  36-37
    2.3 RNA凝胶电泳  37
    2.4 RNA质量的检测  37
  3 结果与分析  37-39
    3.1 酸性酚／氯仿／异戊醇  37-38
    3.2 TrNzol法  38-39
  4 讨论  39-41
    4.1 总RNA的提取过程中应注意的问题  39-40
    4.2 总RNA质量的鉴定  40-41
第四章甜菜夜蛾EcR及USP cDNA片段克隆  41-65
  1 材料与仪器设备  41-42
    1.1 试剂与用品  41
    1.2 培养基配法  41
    1.3 仪器设备  41-42
    1.4 PCR引物的设计  42
  2 实验方法  42-46
    2.1 cDNA的合成  42-43
    2.2 甜菜夜蛾蜕皮激素受体及超气门蛋白cDNA片段克隆  43-46
      2.2.1 PCR扩增  43
      2.2.2 PCR产物回收  43-44
      2.2.3 连接反应  44
      2.2.4 大肠杆菌感受态的制备  44
      2.2.5 转化  44-45
      2.2.6 转化子的筛选  45
      2.2.7 菌落PCR鉴定  45
      2.2.8 测序和序列分析  45-46
  3 结果与分析  46-59
    3.1 cDNA第一链  46
    3.2 PCR结果  46-49
    3.3 菌落PCR鉴定结果  49-50
    3.4 EcR及USP cDNA片段克隆测序结果及分析  50-59
      3.4.1 EcR目的片段的测序结果  50-52
      3.4.2 EcR目的片段同源性分析  52-55
      3.4.3 USP目的片段的测序结果  55-56
      3.4.4 USP目的片段同源性分析  56-59
  4 讨论  59-65
    4.1 关于逆转录反应  59
    4.2 PCR反应的特异性、效率的影响因素  59-61
    4.3 提高RT-PCR的灵敏性  61-62
    4.4 PCR片段的分离与测序  62-63
    4.5 测序结果讨论  63-65
全文总结  65-66
参考文献  66-77
致谢  77-78
攻读硕士期间论文发表情况  78

甜菜夜蛾对昆虫生长调节剂敏感性测定及蜕皮激素受体cDNA克隆

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