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指状青霉（Penicillium Digitatum）对抑霉唑抗性及分子机理研究

作　者: 谢清云
导　师: 李红叶
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘绿霉病菌 抑霉唑抗药性 甾醇生物合成抑制剂 CYP51基因
分类号: S481.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 101次
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内容摘要


从杭州水果批发市场、水果销售点收集若干指状青霉菌(Penicillium digitatum)，对其中部分菌株进行抑霉唑的敏感性测定，结果发现，各菌株对抑霉唑敏感性存在差异，并存在抗性菌株。不同甾醇生物合成抑制剂的交互抗性研究发现，抑霉唑抗性菌株对咪鲜胺、氟硅唑、三唑酮均表现正交互抗药性。不同抗性菌株适合度研究结果表明，抗性菌株的致病力与敏感菌相比下降明显，而抗性菌株的产孢能力和菌丝生长速率与敏感菌相比，略有下降。 通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增获得1个抑霉唑敏感和2个抑霉唑抗性的指状青霉(P.digitatum)菌株的14-a-脱甲基酶(CYP51)基因全序列，并克隆到pGEM-Teasy Vector。序列分析表明，敏感菌株Pd23CYP51基因全长2082bp，包含一个读码框的14-a-脱甲基酶基因的完整编码区序列，3个典型真菌内含子序列将该基因分成4个外显子序列共同编码一个516aa的蛋白质。抗性菌株Pd01和Pd07的CYP51基因全长均为2586bp。 序列比较表明Pd01、Pd07和Pd23的CYP51基因结构基本一致，所不同是Pd01和Pd07的CYP51启动子上游均增加了4个序列一致、长度为126bp的串联重复序列；同时敏感菌株第208、308和437位的氨基酸分别为：甘氨酸、酪氨酸和组氨酸，而抗性菌株则为丙氨酸、组氨酸和酪氨酸。但是，有关指状青霉对抑霉唑抗性产生与126bp串联重复及几个氨基酸取代之间的关系，还有待克隆比较更多抑霉唑敏感性不同菌株的CYP51基因序列、CYP51基因表达差异以及真菌的遗传转化研究来得到进一步的验证。

全文目录


致谢  3-4
中文摘要  4-8
引言  8-10
第一章 文献综述  10-21
  1 甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂抗药性概况  10-11
  2 甾醇生物合成抑制剂的杀菌作用机理  11-12
  3 病原真菌对SBIs类杀菌剂抗药性的遗传  12-13
  4 植物病原真菌对SBIs杀菌剂的抗药性机制  13-21
    4．1 ABC运输体基因在抗药性中的作用  13-16
      4．1．1 酵母中的ABC运输体  13-14
      4．1．2 丝状真菌ABC运输体  14-15
      4．1．3 ABC运输体参与植物防卫反应产物的排出  15-16
    4．2 CYP51基因在抗药性中的作用  16-18
      4．2．1 真菌的CYP51基因研究概况  16
      4．2．2 CYP51发生点突变导致酶与药剂的亲和性下降  16-18
      4．2．3 CYP51基因表达水平的改变  18
    4．3 其它可能的抗性机制  18-21
      4．3．1 麦角甾醇合成过程中除14-α脱甲基酶外的其它酶靶标位点的修饰  18-19
      4．3．2 菌体通过代谢解除DMIs杀菌剂的毒性  19
      4．3．3 可诱导的抗药性机制  19-21
第二章 指状青霉对抑霉唑的抗性研究  21-31
  2．1 实验材料  21
    2．1．1 供试药剂  21
    2．1．2 供试菌株  21
    2．1．3 培养基  21
  2．2 实验方法  21-23
    2．2．1 病菌的分离与纯化  21-22
    2．2．2 病菌对杀菌剂敏感性的离体测定  22-23
    2．2．3 抗性菌株适合度测定  23
      2．2．3．1 菌丝生长速率的测定  23
      2．2．3．2 致病力的测定  23
      2．2．3．3 产孢能力的测定  23
  2．3 结果与分析  23-29
    2．3．1 田间菌株的敏感性测定与抗性划分  23-24
    2．3．2 抗性水平测定  24-25
    2．3．3 交互抗性测定  25-26
    2．3．4 抗性菌株适合度测定  26-29
      2．3．4．1 抗性菌株与敏感菌株菌丝生长量的比较  26-27
      2．3．4．2 抗性菌株与敏感菌株产孢能力的比较  27-28
      2．3．4．3 抗性菌株与敏感菌株致病力的比较  28-29
  2．4 讨论  29-31
    2．4．1 病原真菌对DMIs杀菌剂的抗药性  29
    2．4．2 抑霉唑抗性划分  29-30
    2．4．3 抑霉唑抗性与适合度的关系  30
    2．4．4 DMIs杀菌剂的交互抗性  30-31
第三章 CYP51基因克隆研究  31-49
  3．1 实验材料  31
    3．1．1 DNA来源  31
    3．1．2 细菌菌株  31
    3．1．3 抗菌素  31
    3．1．4 主要分子生物学试剂  31
  3．2 实验方法  31-37
    3．2．1 柑桔绿霉菌基因组DNA的提取  31-32
    3．2．2 引物的设计与合成  32-33
    3．2．3 PCR扩增  33
    3．2．4 电泳  33
    3．2．5 PCR产物回收及纯化  33-34
    3．2．6 PCR产物的连接  34
    3．2．7 感受态细胞的制备  34-35
    3．2．8 连接产物的转化  35
    3．2．9 重组克隆的筛选与鉴定  35-36
    3．2．10 重组质粒鉴定  36
    3．2．11 序列测定和分析  36-37
      3．2．11．1 重组质粒的提取和纯化  36-37
      3．2．11．2 序列测定及分析  37
  3．3 结果与分析  37-47
    3．3．1 CYP51基因克隆  37-38
    3．3．2 序列测定和基因结构分析  38-39
    3．3．3 同源性比较  39
    3．3．4 抑霉唑抗性和敏感菌株间CYP51基因序列比较  39-47
  3．4 讨论  47-49
    3．4．1 丝状真菌对SBI类杀菌剂抗性机制  47
    3．4．2 插入的串联重复序列与抗性的关系  47-48
    3．4．3 氨基酸取代与抗性的关系  48-49
参考文献  49-54
英文摘要  54-56
附录A 本论文所用缩写词及中英文对照  56-57
附录B 常用培养基及主要试剂的配置  57-58

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 植物化学保护理论 > 抗药性
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