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浙江衢州地区柑橘绿霉菌对抑霉唑和多菌灵的抗性及其抗性分子机制的研究

作　者: 冯丹
导　师: 李红叶
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 柑橘绿霉菌(Penicillium digitatum) 14-α-脱甲基抑制剂(DMI) 抑霉唑抗性(IMZ-R) 14-α-脱甲基酶基因(CYP51) 基因突变
分类号: S436.66
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


柑橘绿霉病（Penicillium digitatum）是贮藏柑橘的最主要病害,引起的损失占采后损失的90%以上。化学防治是控制柑橘绿霉病的最有效的方法,但随着药剂的长期使用,抗药性菌株不断产生,从而带来防治效果下降甚至失效的问题。为探讨浙江衢州产区柑橘绿霉菌的对常用药剂抑霉唑和多菌灵的抗性现状和分子机制,本研究评价了来自衢州市,包括柯城区、衢江区和开化县12个贮藏库的70个柑橘绿霉病菌菌株对抑霉唑和多菌灵的抗性水平及其分子机制。结果表明,柯城区和衢江区的抑霉唑抗性菌株（最低抑制浓度（MIC）≥0.5μg/ml）的比例分别为77.1%和62.5%。两地抗性菌株的平均ECso值分别为2.07±1.04Hg/mL和2.35±0.73μg/mL,分别是当地敏感菌株EC50的41.4和47倍。而来自开化县的菌株均对抑霉唑敏感（MIC≤0.1μg/mL）,平均EC50值为0.04±0.02μg/mL。柯城区和衢江区的多菌灵抗性菌株（MIC≥10μg/mL）的比例分别为54.3%和54.2%,而开化县的抗性菌株比例仅为9.1%。本研究克隆测定8个多菌灵敏感菌株和10个多菌灵抗性菌株的β-微管蛋白基因全长序列,比对分析后发现敏感菌株的1255位核苷酸序列为TTC,其编码的氨基酸（200位）为苯丙氨酸,而在抗性菌株中相应位点的核苷酸为序列为TAC,编码的氨基酸为络氨酸。除此外,没有发现其他与抗性相关的突变。因此推断来自浙江衢州的柑橘绿霉病菌对多菌灵的抗性与其β-微管蛋白200位氨基酸由苯丙氨酸突变成络氨酸相关。已知抑霉唑靶标基因（CYP51）启动区的4个额外的126bp片段简单串联重复插入（IMZ-R1）和其中一个199bp片段的插入（IMZ-R2）与柑橘绿霉菌抑霉唑抗性相关。使用检测区分这两种抗性分子机制的引物对CYP51A1/CYP51R2, PCR扩增发现,来自衢州的所有抗抑霉唑绿霉菌的抗性分子机制既不属于IMZ-R1也不属于IMZ-R2;测序比较敏感菌株和抗性菌株CYP51基因的全长序列,也未发现与抗性相关的点突变。通过查找柑橘绿霉菌转录组数据库,发现两个CYP51同源基因的EST序列,命名为PdCYP51B和PdCYP51C基因。结合NCBI上产黄青霉（NS000201）的同源物种信息,设计了CYP51B-R/CYP51B-F和CYP51C-R/CYP51C-F两对引物,成功从抑霉唑敏感菌株PdKH8菌株中克隆到包括启动子和编码区在内PdCYP51B和PdCYP51C两个全长基因。PdCYP51B包含2919bp,包括1751bp完整的编码区,以及它上游742bp的序列和下游425bp的序列,含有3个分别为73bp、51bp、52bp的外显子,分别位于989bp与1061bp之间,1260bp与1310bp之间,和2376bp与2427bp之间,编码485个氨基酸序列。PdCYP51B在GenBank中的登录号为HQ724322.PdCYP51C,包括一个1497bp的开放阅读框,含有分别位于541bp与596bp,682bp与733bp,823bp与885bp,1177bp与1242bp,和1292bp与1348bp之间的5个外显子,编码496个氨基酸序列。PdCYP51C在GenBank中的登录号为HQ724324。序列分析表明PdCYP51B基因与烟曲霉（AfCYP51B, XP749134.1）和小麦赤霉病菌（FgCYP51B, FGSG01000）有78%和61%一致性。PdCYP51C与禾谷镰刀菌（FgCYP51C, FGSG11024）和尖孢镰刀菌（FoCYP51C, FOXG13138）有19%的一致性。PdCYP51B与PdCYP51A和PdCYP51C有59%和22%的一致性,而PdCYP51C基因与PdCYP51A有23%的一致性。克隆、测序并比较8个抑霉唑敏感（IMZ-S）和1个IMZ-R1、1个IMZ-R2,以及6个IMZ-R3菌株的CYP51B和CYP51C基因序列,发现这些菌株的CYP51C基本一致,未发现与抗性相关的点突变,但是,在所有IMZ-R3菌株的CYP51B基因启动子区均发现有一个199bp序列的插入,而该片段在所分析的IMZ-S、IMZ-R1和IMZ-R2菌株中均不存在。因此推测,IMZ-R3菌株的抗性机制与该菌株的CYP51基因启动子去的199bp插入相关。基于该分子机制,我们设计了一对检测IMZ-R3的引物,对来自衢州的IMZ-R3菌株进行PCR扩增,结果发现,能从所有这些抗性菌株中扩增到预期的片段。因此,认为衢州柑橘绿霉菌的抑霉唑抗性菌株的抗性分子机制均属于CYP51B基因启动子区有199bp序列的插入。

全文目录


致谢  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章 柑橘绿霉病的化学防治、病菌抗药性及其分子机制的国内外研究进展  13-24
  第一节 柑橘绿霉病及其危害性  13-14
  第二节 柑橘绿霉病的化学防治  14-18
    2.1 化学防治药剂种类  14-18
      (1) 苯并咪唑类  15
      (2) DMI类杀菌剂  15-16
      (3) 邻苯酚和邻苯酚钠  16
      (4) 新药剂  16-18
  第三节 橘绿霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性现状和抗性分子机制  18-20
    3.1 橘绿霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性现状  18-19
    3.2 橘绿霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性机制  19-20
  第四节 柑橘绿霉菌对14-α-脱甲基抑制剂类杀菌剂(DMIs)的抗性和抗性分子机制  20-24
    4.1 DMI类杀菌剂的作用机理  20-21
    4.2 DMI类杀菌剂的抗性机制  21-22
    4.3 柑橘绿霉菌对DMI类杀菌剂的抗性分子机制  22-24
第二章 浙江衢州地区柑橘绿霉菌对抑霉唑和多菌灵的抗性及其抗性分子机制的研究  24-44
  2.1 前言  24-26
  2.2 材料与方法  26-28
    2.2.1 材料获得与引物序列  26
    2.2.2 供试药剂  26
    2.2.3 基因组DNA提取  26-27
    2.2.4 CYP51与PdTUB2基因的克隆  27-28
  2.3 对多菌灵、抑霉唑的抗性测定  28
    2.3.1 对多菌灵抗性测定  28
    2.3.2 对抑霉唑抗性测定  28
  2.4 对多菌灵、抑霉唑的抗性分子机制测定  28-30
    2.4.1 对多菌灵的机制测定  28-29
    2.4.2 用CYP51A1/CYP51R2引物测定抑霉唑抗性机制  29
    2.4.3 PdCYP51B和PdCYP51C基因的克隆  29
    2.4.4 序列对比  29
    2.4.5 用CYP51B-R/CYP51B-F引物测定抑霉唑抗性机制  29-30
  2.5 交互抗性测定  30
  2.6 实验结果  30-39
  2.7 结论与讨论  39-43
  2.8 有待开展的工作  43-44
参考文献  44-51

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 柑桔类病虫害
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