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Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13机制的研究

作　者: 王敏
导　师: 黄茂
学　校: 南京医科大学
专　业: 呼吸内科
关键词: PBMCs HDAC HAT 荧光酶联免疫法支气管哮喘 IL-4 IL-5 IL-13 ELISA 实时定量PCR IL-17A IFN-γ TP
分类号: R562.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13机制的研究支气管哮喘是一种严重危害人民身体健康的常见病、多发病。近年来,其发病率在全球范围内呈上升趋势。目前认为,支气管哮喘是以气道狭窄、高反应性和气道炎症为特征的一组综合征,气道的炎症是前两者的基础。在多种遗传和环境因素共同作用下,经过巨噬细胞(包括树突状细胞)的抗原呈递作用,相关淋巴细胞(如T细胞等)被活化,释放IL-4、IL-5、IL-13等多种Th2细胞因子,促进了支气管哮喘的形成和发展。既往研究表明,哮喘患者支气管粘膜、外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白乙酰化酶(HAT)活性明显高于正常对照,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性则减弱。应用HDAC抑制剂TSA抑制HDAC活性后,PBMCs能向Th2表型转化,IL-4、IL-5和IL-13等Th2细胞因子表达明显增加。上述研究表明,HDAC/HAT活性可能与T细胞IL-4、IL-5和IL-13等Th2细胞因子表达调控密切相关,但其中的机制尚待明确。CD3/CD28双信号通路对淋巴细胞的刺激能够模拟其在体内受抗原活化产生Th2细胞因子的过程。本课题观察PBMCs经CD3/CD28活化后HDAC/HAT活性的变化及IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A的基因表达,研究HDAC/HAT和IL-17A在哮喘和过敏性疾病中的作用,并探讨糖皮质激素地塞米松(dexamethasone,Dex)和平喘中药雷公藤有效成分雷公藤甲素(Triptolide,TP)抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13的机制。第一部分: PBMCs活化后HDAC /HAT活性的动态变化目的:研究PBMCs在CD3/CD28单克隆抗体共刺激活化后,细胞核内HDAC /HAT活性的动态改变,以及Dex和TP对两者活性的影响,探讨HDAC /HAT在支气管哮喘等过敏性疾病中的发病机制。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)双信号通路对PBMCs进行共刺激,分别在0min、1h、4h、24h时采用荧光酶联免疫法观察HDAC /HAT活性,并观察不同浓度的Dex和TP对两者活性的影响。结果:PBMCs细胞在CD3/CD28共刺激活化后,细胞核内的HDAC活性逐渐减弱,而HAT活性逐渐增强,并且呈现出时间依赖性。Dex(10-8M、10-10M)和TP(100nM、500nM)可抑制HAT活性和增强HDAC活性,其抑制效应呈浓度和时间依赖性。结论:PBMCs细胞经过CD3/CD28共刺激活化后细胞核内HDAC活性减弱,而HAT活性增强,可能是哮喘气道变应性炎症的形成和发展机制之一;Dex和TP抑制PBMCs的HAT活性和增强HDAC活性,可能是其减轻哮喘气道炎症的重要机制之一。第二部分:Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13的机制目的:研究PBMCs在CD3/CD28单克隆抗体共刺激活化后,细胞内IL-4、IL-5和IL-13的表达,以及Dex和TP对三者表达的影响。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)对PBMCs进行共刺激,分别在0min、24h、48h、72h时采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测细胞培养上清中IL-4、IL-5和IL-13的蛋白浓度;并用实时定量PCR的方法检测PBMCs分别在0min、6h、12h、24h不同时间段,细胞内IL-4、IL-5和IL-13mRNA的表达水平;同时观察不同浓度的Dex和TP对上述三种细胞因子表达的影响。结果: CD3/CD28单克隆抗体刺激的PBMCs培养上清中的IL-4、IL-5和IL-13的蛋白浓度明显升高,呈时间依赖性。Dex和TP可不同程度降低IL-4、IL-5和IL-13的蛋白水平,其效应呈浓度依赖性。CD3/CD28单克隆抗体共刺激后,PBMCs内IL-4、IL-5和IL-13 mRNA表达增加,在24h时TP(100nM、500nM)和Dex(10-8M)均能够明显抑制三者基因的表达。结论:PBMCs经CD3/CD28单克隆抗体刺激免疫活化后,其分泌的IL-4、IL-5和IL-13明显增加,是哮喘气道变应性炎症的形成和发展机制之一。Dex和TP可能是通过抑制HAT活性、增强HDAC活性,抑制了IL-4、IL-5、IL-13等炎症基因的表达。第三部分:TP对活化PBMCs细胞IL-17A和IFN-γ表达的影响目的:研究PBMCs细胞在CD3/CD28单克隆抗体共刺激活化后,细胞培养上清中IL-17A和IFN-γ蛋白表达水平,以及TP对两者蛋白表达的影响。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)对PBMCs进行共刺激,采用酶联免疫法(ELISA方法)检测细胞培养上清中IL-17A和IFN-γ蛋白浓度,同时观察不同浓度TP(100nM、500nM)对上述两种蛋白表达的影响。结果:PBMCs经CD3/CD28单克隆抗体刺激后,其分泌的IL-17A和IFN-γ在6h内即明显增加,并在24h内呈继续增高的趋势;100nM和500nM浓度的TP均能够显著抑制该细胞分泌IL-17A和IFN-γ。结论:PBMCs经CD3/CD28刺激活化后,其分泌的IL-17A明显增加,可能是哮喘气道变应性炎症的形成和发展机制之一;TP抑制PBMCs分泌IL-17A,可能是其治疗哮喘的机制之一。综合上面三部分结果,我们可以得出:①HDAC/HAT活性可能与T细胞IL-4、IL-5和IL-13等Th2细胞因子表达调控密切相关;②Dex和TP可能是通过抑制HAT活性、增强HDAC活性,从而抑制了IL-4、IL-5、IL-13等炎症基因的表达;③TP可通过抑制PBMCs对IL-17A的分泌,从而在哮喘和过敏性疾病中发挥一定的治疗作用。

全文目录

中英文对照表  4-5
中文摘要  5-9
Abstract  9-13
第一部分：PBMCs活化后HDAC/ HAT活性的动态改变  13-26
  一. 引言  13-14
  二. 材料和方法  14-18
  三. 结果  18-20
  四. 讨论  20-23
  参考文献  23-26
第二部分：Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13的机制  26-44
  一. 引言  26-27
  二. 材料和方法  27-32
  三. 结果  32-40
  四. 讨论  40-42
  参考文献  42-44
第三部分：TP对活化PBMCs细胞IL-17 A和IFN-γ表达的影响  44-54
  一. 引言  44-45
  二. 材料和方法  45-47
  三. 统计学分析  47-48
  四. 结果  48-49
  五. 讨论  49-52
  参考文献  52-54
研究总结  54-55
研究生期间完成的综述及论文  55-56
综述组蛋白去乙酰化酶在哮喘和过敏性疾病发病机制中的作用  56-64
  参考文献  61-64
论著雷公藤甲素对外周血单个核细胞白细胞介素17A分泌的影响  64-72
  参考文献  70-72
致谢  72

Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13机制的研究

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