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IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用

作　者: 周宇
导　师: 王永山；范红结
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性法氏囊病病毒 VP2基因 模拟表位 组合基因 间接ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病不仅引起患病动物死亡,而且还导致机体免疫抑制,使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败。对易感鸡群实施疫苗接种是预防该病最有效的方法,但由于各地流行的IBDV毒株的毒力与抗原性的差异,给疫苗毒株的选择造成较大的困难,每年因IBD发病死亡、免疫抑制、免疫失败造成的经济损失巨大。目前广泛应用中等毒力的IBD活疫苗,给IBD的防控带来极大的隐患,灭活疫苗存在着抗原制备的困难。因此,进一步研制新型基因工程疫苗,仍是当前禽病防控工作中亟待解决的重要课题。试验1：IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5e与vp2基因连接构建组合基因vp2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHT中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBacHT-vp2-5e,用脂质体法转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒vBacHT-vp2-5e。对vBacHT-vp2-5e感染的Sf9细胞,以间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光；电镜检查,重组VP2-5E蛋白能够自组装成病毒样颗粒(VLP)；用免疫印迹分析(Western-blotting),在59kD处出现一条特异性蛋白条带。试验2：IBDV模拟表位与vp2组合基因重组蛋白的应用用IBDV模拟表位与vp2组合基因重组蛋白免疫SPF鸡,第一次免疫14d后,组合基因重组蛋白组的ELISA抗体效价为1746,攻毒死亡率为40%,而用单一VP2重组蛋白组的ELISA抗体效价为1359,攻毒死亡率为50%；第二次免疫14 d后,组合基因重组蛋白组ELISA抗体效价上升到4598,攻毒死亡率为0%,单一VP2重组蛋白组抗体效价为4044,攻毒死亡率为10%。实验结果表明,组合基因重组蛋白免疫鸡可以抵抗IBDV强毒攻击且优于单一VP2重组蛋白。以组合基因重组蛋白VP2-5E作为包被抗原,建立了IBDV抗体ELISA检测方法,重组抗原包被浓度为5μg/mL,被检血清样品1：400稀释。特异性试验表明,与新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、禽流感病毒H9N2亚型的阳性血清均无交叉反应；重复性试验结果表明,间接ELISA方法批内、批间变异系数小于10%。将本实验建立的方法与IDEXX公司ELISA检测试剂盒进行了比较,检测200份IBDV血清样品,阳性符合率为92.9%,阴性符合率100%。实验结果表明,本实验建立的IBDV抗体ELISA检测方法具有良好的特异性与重复性。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12缩略语表  12-13第一篇 文献综述  13-35  1 IBDV概述  13-14  2 IBDV病原学特性  14-16    2.1 IBDV结构特性  14-15    2.2 理化特性  15    2.3 生物学特性  15-16  3 IBDV基因组结构及蛋白功能  16-19    3.1 IBDV基因组结构  16    3.2 病毒蛋白及其功能  16-19      3.2.1 VP1蛋白  17      3.2.2 VP2蛋白  17-18      3.2.3 VP3蛋白  18-19      3.2.4 VP4蛋白  19      3.2.5 VP5蛋白  19  4 IBD的防控  19-28    4.1 IBD的检测  19-20    4.2 IBD的预防  20-28      4.2.1 常规疫苗  20-21      4.2.2 基因工程疫苗  21-24      4.2.3 表位疫苗  24-28  参考文献  28-35第二篇 研究内容  35-63  第一章 IBDV模拟表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达  35-47    1 材料与方法  36-39      1.1 质粒、菌种和细胞  36      1.2 主要试剂  36      1.3 组合基因的分子设计与克隆  36-37      1.4 组合基因重组供体质粒的构建  37-38      1.5 组合基因重组杆状病毒表达质粒的构建  38      1.6 组合基因重组杆状病毒的获得  38-39      1.7 组合基因重组杆状病毒的鉴定  39        1.7.1 IFA检测  39        1.7.2 电镜检查  39        1.7.3 免疫印迹分析(Western blotting)  39    2 结果  39-42      2.1 组合基因的分子设计与克隆  39-40      2.2 组合基因重组供体质粒的构建  40      2.3 组合基因重组杆状病毒表达质粒的构建  40      2.4 组合基因重组杆状病毒的获得  40-41      2.5 组合基因重组杆状病毒的鉴定  41-42        2.5.1 IFA  41        2.5.2 电镜检查  41-42        2.5.3 免疫印迹分析(Western blotting)  42    3 讨论  42-44    参考文献  44-47  第二章 IBDV模拟表位与VP2组合基因重组蛋白的应用  47-63    1 材料与方法  48-52      1.1 病毒与试剂  48      1.2 重组杆状病毒的鉴定  48-49        1.2.1 免疫印迹分析(Western blotting)  48-49        1.2.2 电镜检查  49      1.3 组合基因重组蛋白的动物免疫保护试验  49-50        1.3.1 试验动物  49        1.3.2 动物分组与免疫  49        1.3.3 攻毒试验  49-50      1.4 间接ELISA方法的建立  50-51        1.4.1 抗原的制备  50        1.4.2 抗原包被浓度与血清稀释度的确定  50        1.4.3 封闭液的确定  50-51      1.5 间接ELISA试验步骤  51      1.6 间接ELISA临界值的确定  51      1.7 特异性试验  51      1.8 重复性试验  51      1.9 与IDEXX试剂盒的比较试验  51-52    2 结果  52-58      2.1 重组杆状病毒的鉴定  52-53        2.1.1 免疫印迹分析(Western blotting)  52        2.1.2 电镜检查  52-53      2.2 组合基因重组蛋白免疫攻毒试验  53-54      2.3 间接ELISA方法的建立  54-55        2.3.1 包被抗原的制备  54        2.3.2 抗原包被浓度与血清稀释度的确定  54-55        2.3.3 封闭液的确定  55      2.4 间接ELISA临界值的确定  55-56      2.5 间接ELISA的特异性  56      2.6 间接ELISA的重复性  56-57      2.7 与IDEXX试剂盒的比较试验  57-58    3 讨论  58-60    参考文献  60-63全文总结  63-65附录  65-69致谢  69-71攻读学位期间发表的学术论文目录  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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