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结合珠蛋白的分离纯化与鉴定及其与奶牛乳腺炎的关系

作　者: 卢娜
导　师: 邓干臻
学　校: 华中农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 结合珠蛋白奶牛乳腺炎糖蛋白分离纯化纯度鉴定
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

结合珠蛋白(Hp)是一种酸性糖蛋白,属急性期反应蛋白之一,由于所含轻链类型的不同,结合珠蛋白具有遗传多态性。结合珠蛋白主要在肝脏合成,其表达受脂多糖、细胞因子、激素等的调节。结合珠蛋白不同的表现型在临床上有不同的生物学功能,其多型性与许多炎症性疾病包括感染性疾病、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病等的发生及发展有关。乳腺炎是奶牛常见病之一又名乳房炎,是病原微生物(接触性传染病原微生物和环境性病原体)侵入乳房或其他应激因素(其他疾病继发、饲养管理不当等)使乳腺防御能力下降引起实质和间质组织的炎症及乳汁成分的变化。乳腺炎使乳腺组织受到侵害,影响泌乳功能,降低产奶量,造成饲料、医药和劳动力的浪费。同时变质奶的营养价值显著下降,不但危害人的健康,还给奶牛业带来巨大的经济损失。目前对于结合珠蛋白的研究已经比较深入。但是对奶牛结合珠蛋白的研究才刚刚起步,乳腺炎与结合珠蛋白的相关性还没有得到确定和证实。奶牛血清中的结合珠蛋白的分离纯化的条件和鉴定方法还有待弄清。本文以奶牛为研究对象,对患有乳腺炎的奶牛与健康奶牛的血液中的结合珠蛋白做了初步比较;对血清中的结合珠蛋白的提取工艺、分离纯化以及纯化鉴定进行了研究;研究奶牛的结合珠蛋白的亚型的种类分型;分析奶牛血清中的结合珠蛋白含量的变化与奶牛乳腺炎发病的相关性。为进一步探讨血清结合珠蛋白多态性与奶牛的产仔数、公牛的配种能力等繁殖性状和产奶量多少等经济性状的相关关系,筛选优良的遗传性状,为奶牛的选择培育、提高种群的生产性能、改善品种的遗传结构及杂种优势的利用提供可靠的理论依据。奶牛血液通过凝血、离心制成血清,通过SDS-PAGE凝胶电泳比较健康奶牛与患有乳腺炎的奶牛血清中蛋白质的不同,从而得出患有乳腺炎的奶牛血清中含有结合珠蛋白,健康奶牛则没有,可以确定结合珠蛋白与乳腺炎具有相关性。将患有乳腺炎的奶牛血清,用磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液4℃浸提过夜,再用硫酸铵作为浸提液沉淀。以缓冲液pH值、料液比和盐浓度为影响因子,进行三元二次旋转正交实验,得出适合结合珠蛋白的最佳提取工艺:浸提液pH值6.8,浸提液盐浓度0.15 mol/L,料液比1:10,蛋白提取率为9.50%。浸提液经硫酸铵沉淀后进行离心,用蒸馏水复溶沉淀蛋白,经缓冲液透析平衡、聚乙二醇6000浓缩后,用DEAE-Cellulose 52离子交换层析柱进行初步分离,经磷酸钠缓冲液、0.1mol/L NaCl和0.2mo/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱后,收集蛋白峰和糖峰的重合峰。收集该峰的蛋白液,经透析和浓缩后上Sephacryl S-300凝胶层析柱进一步纯化,得到结合珠蛋白。将所得结合珠蛋白使用SDS-PAGE凝胶电泳以及HPLC进行鉴定,证实所得结合珠蛋白为纯品。通过半胱氨酸与2-巯基乙醇的作用将结合珠蛋白降解为亚基,用SDS-PAGE凝胶电泳对其纯度进行了分析。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
1.前言  11-30
  1.1 结合珠蛋白简介及其研究  11-21
    1.1.1 结合珠蛋白的结构与遗传多态性  11-13
    1.1.2 结合珠蛋白的生物学特征  13-15
    1.1.3 结合珠蛋白的功能  15-19
    1.1.4 结合珠蛋白基因多态性的临床意义  19-21
  1.2 奶牛乳腺炎的概况  21-26
    1.2.1 乳牛乳房炎的致病菌及影响因素  21
    1.2.2 奶牛乳腺炎的症状  21-22
    1.2.3 免疫学机制  22-24
    1.2.4 奶牛乳腺炎的危害  24-25
    1.2.5 乳腺炎的诊断  25
    1.2.6 乳腺炎治疗的研究进展  25-26
  1.3 蛋白质的提取和纯化  26-28
    1.3.1 分离纯化的一般步骤与程序  26-27
    1.3.2 蛋白质分离纯化的主要方法  27-28
  1.4 奶牛结合珠蛋白的鉴定和分析  28
  1.5 本实验的目的以及意义  28-30
    1.5.1 目的和意义  28-29
    1.5.2 主要研究内容  29-30
2.奶牛结合珠蛋白的检测  30-35
  2.1 材料与方法  30-33
    2.1.1 实验材料  30-31
    2.1.2 实验方法  31-33
  2.2 结果与分析  33-34
  2.3 讨论  34-35
    2.3.1 关于血清的制备  34
    2.3.2 关于凝胶的配置  34
    2.3.3 关于电泳条件  34-35
3.奶牛血清蛋白的粗提  35-48
  3.1 材料与方法  35-39
    3.1.1 实验材料  35-36
    3.1.2 实验方法  36-39
  3.2 结果与分析  39-46
    3.2.1 血清蛋白提取方法的分析  39
    3.2.2 硫酸铵盐析条件的确定  39-40
    3.2.3 血清蛋白提取工艺优化结果的分析  40-45
    3.2.4 血清蛋白等电点(pI)的测定  45-46
  3.3 讨论  46-48
    3.3.1 关于硫酸铵与血清蛋白沉淀的关系  46
    3.3.2 关于选取影响血清蛋白提取的主要因素  46-47
    3.3.3 关于浸提液对血清蛋白提取的影响  47-48
4 奶牛结合珠蛋白的分离纯化及纯度鉴定  48-63
  4.1 影响填料分离效果的四项指标:  48-49
    4.1.1 分离度  48-49
    4.1.2 流速  49
    4.1.3 蛋白吸附量  49
    4.1.4 体积吸水量  49
  4.2 材料与方法  49-54
    4.2.1 实验材料  49-51
    4.2.2 结合珠蛋白纯化实验方法  51-53
    4.2.3 结合珠蛋白纯度鉴定实验方法  53-54
  4.3 结果与分析  54-61
    4.3.1 离子交换层析  54-55
    4.3.2 凝胶过滤层析法  55-56
    4.3.3 高效液相色谱法  56-59
    4.3.4 SDS-PAGE检测Hp  59-60
    4.3.5 SDS-PAGE检测Hp基  60-61
  4.4 讨论  61-63
    4.4.1 关于DEAE-Cellulose 52离子交换填料  61
    4.4.2 关于Sephacryl S-300凝胶过滤填料  61
    4.4.3 关于HPLC  61-62
    4.4.4 关于SDS-PAGE  62-63
参考文献  63-72
致谢  72

结合珠蛋白的分离纯化与鉴定及其与奶牛乳腺炎的关系

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