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麦胚抗菌肽富集与分离纯化技术研究

作　者: 杨阳
导　师: 顾振新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 麦胚孵育抗菌肽富集分离纯化
分类号: TQ936.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究选用麦胚为原料,采用保温孵育的方法,研究不同孵育条件及孵育液组分下麦胚肽含量和抗菌活性等的变化规律。通过培养条件和培养液组成优化,得到有利于抗菌肽累积的孵育工艺和参数,分析了孵育过程中麦胚主要成分的变化,对孵育得到的抗菌肽进行了分离纯化,同时对其结构进行了探讨。研究结果如下：1、随着麦胚孵育时间延长,其游离氨基酸和多肽含量逐渐增加,可溶性蛋白含量先降低后升高,淀粉含量先上升后下降,还原糖含量逐渐升高后趋于平缓,粗脂肪含量逐渐降低。研磨处理可以促使麦胚中酶与底物充分接触,反应更完全,从而促进肽富集。采用正交设计考察了时间、温度和液料比三因素对麦胚孵育液中肽富集量和抗菌活性的影响。结果表明：麦胚孵育富集抗菌肽的最佳孵育条件是：时间1.0 h、温度45℃和液料比为25：1。在此条件下富集的抗菌肽抑菌圈大小为16.00 mm,是未孵育麦胚的1.23倍。2、采用Plackett-Burman设计考察了CaCl2、ZnSO4、MgSO4、MnSO4、NaCl、KCl、抗坏血酸(Vc)、半胱氨酸(L-cysteine)和谷胱甘肽(GSH)对麦胚孵育液抗菌活性的影响,用最陡爬坡试验和响应面设计对呈显著正效应的添加物进行最佳添加量优化。结果表明：Vc、L-cysteine和GSH对抑菌圈大小呈现显著正效应；经响应面分析显示,抑菌圈大小与培养液组分浓度间的二次多项模型显著(P<0.05),可用于预测和分析麦胚孵育液的抗菌活性。优选出三种有利于麦胚孵育液的抗菌活性的添加物是Vc、L-cysteine和GSH,最佳的添加浓度分别是6.11 mmol/L,26.87 mmol/L和6.78mmol/L。在此条件下孵育的麦胚,富集的抗菌肽抑菌圈直径达到23.63mm,是对照的1.60倍。3、麦胚孵育液经80%乙醇处理,可除去大部分大分子的蛋白、糖等杂质,经超滤后得到四个组分,对这些组分进行抗菌活性检验,结果表明：分子量小于10K的具有抗菌活性。分子量小于10K的组分经SephadexG-25分离,得到三个主要组分G-25-1、G-25-2和G-25-3,抗菌活性检验表明：抗菌活性物质存在于G-25-2中；G-25-2经SephadexG-10进一步分离,得到G-10-1、G-10-2、G-10-3和G-10-4四个组分,分别进行抗菌活性检验：G-10-2具有抗菌活性。G-10-2经半制备型HPLC制得五个组分HPLC-1、HPLC-2、HPLC-3、HPLC-4和HPLC-5,抗菌活性检验表明HPLC-2为所需抗菌肽。ESI-MS质谱分析和氨基酸组成分析表明,麦胚孵育液中HPLC-2抗菌肽分子量为456.84 Da,其氨基酸组成为Glu-Tyr-Phe.对此抗菌肽的抗菌作用进行研究得到：HPLC-2抗菌肽对革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)均有不同程度的抑制作用,对试验所用真菌无明显抑制作用；HPLC-2抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为500μg/ml;分离纯化得到的HPLC-2抗菌肽在100℃下加热1 h的时间内,其活性几乎没有发生变化,表明该抗菌肽具有良好的热稳定性。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11引言 11-12第一章文献综述 12-32 1 麦胚营养成分及其生理功能 12-15 1.1 麦胚的营养成分 12 1.1.1 蛋白质 12 1.1.2 脂类 12 1.1.3 糖类 12-13 1.1.4 维生素 13 1.1.5 矿物质 13 1.2 麦胚的生理功能 13 1.2.1 抗氧化功能 13-14 1.2.2 降血脂功能 14 1.2.3 辅助治疗糖尿病 14 1.2.4 修复辐射损伤 14-15 1.2.5 抗疲劳功能 15 2 生物活性肽 15-18 2.1 生物活性肽的吸收机制 15 2.1.1 吸收方式 15-16 2.1.2 吸收通道 16 2.2 生物活性肽的生理功能 16-17 2.3 麦胚蛋白源生物活性肽 17 2.3.1 血管紧张素转移酶(ACE)抑制肽 17 2.3.2 抗氧化活性肽 17-18 2.3.3 免疫活性肽 18 2.3.4 抗菌肽 18 3 抗菌肽的种类与生理功能 18-22 3.1 抗菌肽的来源 18-19 3.1.1 动物抗菌肽 19-20 3.1.2 微生物抗菌肽 20 3.1.3 植物抗菌肽 20-21 3.2 抗菌肽的作用机理 21 3.2.1 桶状孔道模式 21 3.2.2 毯式模式 21-22 3.2.4 虫蚀样孔道模式 22 4 麦胚生物活性肽的制备 22-23 4.1 天然活性肽的分离提取 22 4.2 化学合成活性肽 22 4.3 基因重组法制取活性肽 22 4.4 蛋白质水解制取活性肽 22-23 5 本研究目的意义及主要研究内容 23-25 5.1 本研究目的意义 23 5.2 主要研究内容 23-25 参考文献 25-32第二章麦胚孵育过程中抗菌肽富集条件优化 32-46 1 材料与方法 32-35 1.1 仪器试剂 32-33 1.2 试验材料 33 1.3 麦胚孵育工艺 33-34 1.4 测定指标与方法 34-35 1.4.1 肽含量 34 1.4.2 抗菌活性 34 1.4.3 常规指标 34-35 1.5 数据分析方法 35 2 结果与分析 35-40 2.1 麦胚主要物质含量 35 2.2 麦胚主要成分含量变化 35-37 2.3 麦胚粗提液中大分子物质脱除 37 2.4 孵育条件对肽含量及抗菌活性的影响 37-40 2.4.1 pH的影响 37-38 2.4.2 时间的影响 38 2.4.3 温度的影响 38-39 2.4.4 液料比的影响 39 2.4.5 正交试验 39-40 3 讨论 40-42 4 本章小结 42-43 参考文献 43-46第三章麦胚孵育过程中抗菌肽富集培养液组分优化 46-58 1 材料与方法 46-47 1.1 仪器试剂 46-47 1.2 试验材料 47 1.3 麦胚孵育工艺 47 1.4 测定指标与方法 47 1.5 数据分析方法 47 2 结果与分析 47-54 2.1 影响抗菌效果关键因子的确定 47-50 2.2 最大响应区域的确定 50-51 2.3 响应面优化培养液组成 51-54 2.4 优化条件验证 54 3 讨论 54-55 4 本章小结 55-56 参考文献 56-58第四章麦胚孵育液中抗菌肽分离纯化与活性检验 58-72 1 材料与方法 58-61 1.1 仪器试剂 58-59 1.2 试验材料 59 1.3 麦胚孵育工艺 59 1.4 质谱分析 59-60 1.4.1 超滤分离 59 1.4.2 柱层析分离 59 1.4.3 制备型HPLC分离 59-60 1.4.4 质谱分析 60 1.5 测定指标与方法 60-61 1.5.1 抗菌活性 60 1.5.2 抗菌肽最小抑菌浓度 60-61 1.5.3 抗菌肽热稳定性 61 1.6 数据分析方法 61 2 结果与分析 61-69 2.1 麦胚孵育液中肽的分离纯化 61-68 2.1.1 麦胚孵育液中肽的超滤 61-62 2.1.2 麦胚孵育液中肽的SephadexG-25分离 62-63 2.1.3 麦胚孵育液中肽的SephadexG-10分离 63 2.1.4 麦胚孵育液中肽的HPLC分离 63-64 2.1.5 抗菌肽的初步鉴定——ESI-MS质谱分析 64-68 2.2 麦胚抗菌肽的抗菌作用研究 68-69 2.2.1 抗菌肽的抗菌谱 68-69 2.2.2 抗菌肽的最小抑菌浓度 69 2.2.3 抗菌肽的热稳定性 69 3 讨论 69-70 4 本章小结 70-71 参考文献 71-72全文结论 72-74致谢 74-76攻读硕士学位期间发表论文 76

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